离子对反相液相色谱中的硫代磷酸寡核苷酸分离：离子对系统的影响

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背景和摘要介绍

合成的寡核苷酸通常经过化学修饰后能够提高其体内抗核酸内切酶和核酸外切酶降解的能力。此外，适当的修饰可以改善细胞摄取和靶向结合特性。一种广泛使用的修饰是核苷酸间连接的磷酸酯。用硫取代磷酸基团中的一个非桥联氧基，形成硫代磷酸酯（硫取代磷酸）键，这种修饰在磷酸基团中引入了手性中心，导致形成2z非对映体，其中z是硫代磷酸酯修饰的数量。由于非对映异构体具有不同的物理化学性质，因此它们可以在常规非手性固定相上分离。由于多个非对映异构体只能部分分离，硫代磷酸酯寡核苷酸的色谱峰比其天然（磷酸二酯）对应物的色谱峰宽。现有的分离技术不能提供足够的分离能力来分离成千上万的非对映异构体。因此，希望能够开发出能够抑制硫代磷酸酯寡核苷酸非对映异构体分离的分离方法，同时保持全长硫代磷酸酯寡核苷酸（n）从其较短的合成杂质中的分离（n-1，n-2…，n-x；x代表截短核苷酸的数量）。

离子对反相液相色谱中的保留机制是一个复杂的问题，可以用静电理论来描述。带正电的离子对试剂（即烷基胺）和带负电的（硫代）磷酸基团之间的相互作用。离子对试剂和分析物的形成中性复合物，离子对试剂在疏水固定相表面的吸附导致离子交换保留机制，这可以解释目标物保留随着离子对（如烷基胺）疏水性的增加而增加。乙酸三丁胺或三乙胺（TEA）-六氟异丙醇（HFIP）系统，被证明可用于硫代磷酸酯寡核苷酸的分析。这种具有强静电效应的离子对系统需要更大量的有机试剂来从反相LC柱中洗脱目标物，这减少了离子与反相固定相的疏水相互作用——这可能是非对映体分离的机理。

用于合成的寡核苷酸分析的广泛使用的离子对系统包括用乙酸缓冲的TEA或HFIP。HFIP多用于LC-MS，因为它在降低胺浓度的情况下提供了有用的分离能力，不会抑制MS信号。不过，HFIP比醋酸盐流动相添加剂昂贵得多。其他一些氟醇，如三氟乙醇，可以用作烷基胺的弱酸缓冲液，但与HFIP相比，色谱行为没有明显变化。

用于离子交换分析的色谱方法使用常规反相柱，即辛烷基、十八烷基和苯基柱，所有烷基反相固定相都表现出类似的保留行为，尽管苯基柱可能提供不同的选择性，但保留机制保持不变（即疏水和静电相互作用的组合）。最近，多个组研究了非对映体上的分离，然而，关于离子对色谱对非对映体分离影响的综合研究尚未发表。

本研究的目的是研究离子对系统的性质及其对硫代磷酸酯寡核苷酸非对映体分离的影响。由于最新一代的反义和siRNA寡核苷酸利用了核苷酸间键的选择性硫取代磷酸修饰，作者研究了具有不同数量和硫代磷酸酯键位置的寡核苷酸。本研究的目的是识别离子对系统，(i)促进非对映体的分离，以在需要时支持部分硫化寡核苷酸异构体的分析；(ii)识别抑制非对映体分离的离子对系统，用于分析全硫化寡核苷酸或具有多重硫代磷酸酯键的寡核苷酸；(iii)研究选定的离子对系统分离n和n-1种合成寡核苷酸的能力。温度对寡核苷酸非对映体分离的影响将在后续的报告中讨论。

材料和方法

色谱柱统一用Premier BEH C18柱，尺寸为50×2.1mm；粒径为1.7μm。对于疏水性烷基胺（即DBA、HA、OA、DHA），为每种流动相类型指定一个柱，以避免不同烷基胺的柱长时间重新平衡。

通过将分析物溶解在浓度为50pmol/μl的去离子水中制备所有测试离子的储备溶液。将第一个系统峰用作柱排空时间标记。每个样品重复测定三次，均采用梯度洗脱。流动相 B是水相，由10mM或100 mM烷基胺组成，用乙酸调节pH至8.0。或者流动相 B是10 mM或100 m M醋酸铵水溶液，用氨水溶液调节pH值至8.0（反相分离模式，流动相不含烷基胺）。流动相A由ACN/水80/20（w/w）组成，添加与流动相B相同量的烷基胺和乙酸以达到相同浓度。

测试了以下离子对系统：乙酸二乙酯胺（DEAA）、乙酸三乙酯胺（TEAA）、乙酸二异丙胺（DIPAA）、乙酸二丙胺胺（DPAA）、乙酸双丁胺（DBAA）、乙酸己基胺（HAA）、乙酸辛基胺（OAA）和乙酸二己胺（DHAA）。为了制备流动相 TEA-HFIP，将三乙胺（达到5 mM浓度）加入50 mM含水HFIP溶液（流动相 B）。基于HFIP的流动相 B的未调整pH值为8.5。流动相 A由ACN/水50/50（w/w）组成；加入与流动相 B中相同量的TEA和HFIP（分别为5mM和50mM）。无论使用何种离子对系统，所有实验的梯度斜率均为1%ACN/分钟。根据紫外光谱测量，检测波长为260 nm。所有实验的柱温均为60℃。

所有烷基乙酸铵流动相均用醋酸调整至pH值8.0。在此pH下，磷酸（硫代磷酸酯）核苷酸键带负电，并与带正电的离子对试剂相互作用。所有使用的烷基胺的pKa值在10.5~11.5范围内，因此即使在有机溶剂存在下，它们在pH8.0下也完全带正电[33]。流动相 A和B都含有相同量的离子对，确保离子对的浓度在梯度期间保持恒定。选择初始梯度强度，使21mer磷酸二酯寡核苷酸在每分钟1%ACN梯度下保持约10分钟。用选定的离子对系统研究了所有21mer相同序列但不同数目硫取代磷酸键的相对保留和非对映体分离。

结果和讨论

流动相中的离子对添加剂已用于改善高极性离子分子的保留。保留机制可以用静电理论解释，其中疏水离子对在流动相和固定相之间形成平衡。离子对添加剂其类型（疏水性、烷基链长度）以及浓度对保留率有直接影响。离子交换反相液相色谱中离子的洗脱是通过有机溶剂梯度实现的。有机溶剂减少了吸附在反相固定相上的带正电的烷基胺的数量，并抵消了离子与固定相的静电和疏水作用。离子交换反相液相色谱中寡核苷酸的保留主要取决于离子对系统的“疏水性”，这与a）烷基胺结构中的碳原子数和b）烷基胺结构中烷基链的支化有关。

寡核苷酸是极性分子，在没有离子对试剂或TEAA缓冲液的情况下，只需要流动相中很少百分比ACN即可将之从C18柱上洗脱。研究表明，离子（类似于蛋白质）的保留强烈依赖于流动相中的有机相含量，离子在有机相百分比的窄范围内洗脱。这一现象可用于比较相对保留率和烷基胺离子对系统的“强度”。图1显示了使用100 mM和10mM  离子对流动相洗脱all硫取代磷酸和allPO分析物时流动相中ACN的百分比。

随着更长（更疏水）的烷基胺观察到更强的离子保留，因为离子对试剂更有效地吸附在C18 固定相上并促进更强的静电保留（图1）。与allPO相比，allPS的保留率略高， ACN百分比趋势相似（见图1）。该信息可用于不同离子对系统的方法开发，例如选择需要的乙腈初始百分比，以实现具有平缓梯度的合理寡核苷酸洗脱时间。

图1可用于对离子对系统的强度进行排序，类似于最近提出的方法。二乙胺或三乙胺可归类为弱离子对，而己基、辛基和二己基胺为强离子对。烷基链长度是决定离子对表观疏水性的主要因素。尽管TEA、DIPA、DPA和HA有6个碳原子，但寡核苷酸保留率随着离子对烷基链长度的增加而增加：TEAA<dipaa<dpaa<haa<span="">。烷基胺分支对寡核苷酸保留的影响之前已有报道。观察到OAA的类似行为，其对寡核苷酸的保留显著高于分支DBAA，尽管两种离子对试剂都有8个碳原子。图1显示，保留也取决于缓冲液浓度，但保留主要取决于离子对系统的疏水性。

硫代磷酸寡核苷酸中存在的非对映异构体由于其在离子交换反相液相色谱中的部分分离而使其分析复杂化。在图2和图S2中可以观察到支持材料的这种效果。

图2显示了不含有、一个、两个、四个或六个核苷酸间硫取代磷酸修饰的共同序列的五个21聚寡核苷酸的样品。梯度为1%ACN/min。调整梯度开始，在类似洗脱时间内洗脱寡核苷酸。如前所述，在所有实验中，图1中获得的allPO寡核苷酸数据，硫取代磷酸寡核苷酸表现出非对映体分离引起的“峰加宽”效应。这种效应在图2中的TEAA色谱图中最为明显；allPO寡核苷酸首先以单峰形式洗脱，1个硫取代磷酸5′洗脱后分离为2个异构体，然后1个硫取代磷酸 3′5′分离为4个异构体。峰4（由16个部分拆分的异构体组成的2个硫取代磷酸 3''5''寡核苷酸）因部分非对映异构体拆分而显示为宽峰，而最后一个洗脱峰5（2个硫取代磷酸 center 3''5''寡核苷酸）由于存在64个重叠的异构体而非常宽（关于磷酸化位置的示意图序列，见表1）。

图2说明了硫取代磷酸寡核苷酸的峰“加宽”机制。对于弱离子对试剂，非对映体分离度更明显，而对于更强的离子对系统，它似乎受到抑制（图2）。根据这些结果，假设非对映体分离是由与C18 固定相的疏水相互作用引起的，在低浓度的ACN与亲水性烷基胺的离子交换反相液相色谱中更为明显（图1）。强离子对试剂需要高百分比的ACN来洗脱寡核苷酸，从而减少非对映体分离。然而，非对映体分离抑制是不完全的。对图2和表S3-S12（支持材料）的检查表明，对于所有离子对系统，硫取代磷酸寡核苷酸峰比allPO寡核苷酸宽。同样，静电相互作用也有助于非对映体的分离，如阴离子交换（AEX）LC[50]或毛细管区带电泳[51]中所观察到的。根据图2中的结果，DPAA、DBAA和HAA 离子对系统有望在抑制异构体分离的情况下分离all硫取代磷酸寡核苷酸。

图3显示了在10mM 离子对缓冲液中对另一种序列相同但硫取代磷酸修饰数不同的21聚体寡核苷酸混合物进行的分离。该混合物包括allPO寡核苷酸、两个具有1硫取代磷酸连接的寡核苷酸（位于5’或3’端）、具有两个硫取代磷酸键（5’或3’端）的寡核苷酸、具有4硫取代磷酸连接的低聚核苷酸（两个末端都有两个硫取代磷酸链接）和具有6硫取代磷酸连接的寡核苷酸（末端和中心均具有两个硫代；见表1）。分离趋势与图2中观察到的趋势一致；亲水性离子对试剂增强了非对映体的分离。与预期的100 mM缓冲实验（图2）相比，由于通过离子对机制实现的保留率较低，寡核苷酸的总体保留率降低。同一序列的寡核苷酸的保留随着硫取代磷酸连接的数量而增加（图2和图3中都有体现）。这可以通过负电荷的离域化来解释，这使得硫代磷酸酯更强烈地保留在AEX中，并使与硫取代磷酸寡核苷酸的离子对相互作用更强。然而，在图3的大多数离子对系统中，两个具有单一硫取代磷酸键的寡核苷酸（图3中的峰2和峰3）彼此分离。对放置在3’或5’中心的1硫取代磷酸和2硫取代磷酸键修饰的额外寡核苷酸也观察到了类似的结果（图3中未示出数据）。因此，寡核苷酸的保留并不严格遵循硫代化程度，它还取决于序列中硫取代磷酸键的位置（见支持材料中的表S3-S12）。虽然分离具有不同数量硫取代磷酸键的离子不是这项工作的主要目标，但它对于分析治疗性硫取代磷酸寡核苷酸氧化是有用的。

已知硫取代磷酸修饰寡核苷酸可提高体内对核酸外切酶和核酸内切酶的寡核苷酸抗性5’和3’末端的有限硫代化比全硫取代磷酸寡核苷酸修饰更有利。这一策略导致形成有限数量的非对映异构体，这些非对映体可以进行色谱解析。当需要非对映体分离时，图2和3中的结果表明，建议使用亲水离子对系统。然而，这种离子对系统对于分离n和n-x杂质可能效率较低。n和n-x的分离将在下一节进行研究。

LC分析的主要目标是将目标寡核苷酸从其较短的合成杂质（n-x）或代谢物中分离出来。因此，研究离子对系统对两个选定对象（即all硫取代磷酸和1硫取代磷酸center离子）分离n和n-1（即21聚体和20聚体）的能力（见图4）。还研究了all硫取代磷酸寡核苷酸的n和n-2聚体（21聚体和19聚体）、n和n-3聚体（21聚体和18聚体）、n-1和n-2（20聚体和19聚体）以及n-2和n-3（19聚体和18聚体）的分离度（参见支持材料中的表S13和图5）。所有n-x都是同步制备的，序列在5''端被x个核苷酸截断。这种离子代表了全长离子合成中产生的典型杂质。n和n-1多聚体的基线分离度（分离度R>1.5）适用于寡核苷酸纯度测量和定量。

图4总结了两个观察到的趋势：（i）更多的疏水离子对系统提供了更高的n和n-1分离度（21/20聚体），以及（ii）对于n和n-1分离，100 mM 离子对系统在大多数情况下比10 mM 离子对更有效。这些发现与离子对分离的静电假设一致，离子对试剂的高浓度和疏水性导致固定相表面形成更大的电荷密度。如前所述，在相对疏水的离子对系统中抑制非对映体拆分也改善了n和n-1寡核苷酸的分离。all硫取代磷酸寡核苷酸和1硫取代磷酸center寡核苷酸的数据的比较（图4）表明，1硫取代磷酸center寡核苷酸的n和n-1分离度通常大于所有的硫取代磷酸寡核苷酸样本。作者认为这是由于all硫取代磷酸寡核苷酸中存在多个非对映异构体导致的部分峰展宽；表S3-S11表明，all硫取代磷酸峰始终比相同序列的部分硫代或磷酸二酯峰宽得多。唯一的例外是在TEA+HFIP流动相中观察到的（图4）；TEA+HFIP系统中离子的分离将在下一节讨论。

作者还分析了18-21聚体的all硫取代磷酸混合物，以表示受合成n-x杂质污染的全长寡核苷酸。图5显示，在更疏水的离子对系统可以实现所有四个离子（18-21聚体）的可接受分离度。AmAc和DEAA在任何浓度下都不能提供18-21聚体峰的分离度（见支持材料中的表S13）。TEAA、DIPAA和DPAA提供了不同长度硫代磷酸酯寡核苷酸的部分分离，对于100mM 离子对浓度，分离得到显著改善（参见图5中的DIPAA示例以及支持材料中表S13中的TEAA和DPAA数据）。疏水离子对系统能够在10mM和100mM 离子对浓度下实现所有18聚体–21聚体 硫取代磷酸 寡核苷酸峰的基线分离度。在100mM浓度下观察到明显更宽的峰，尤其是对于100mM DHAA（图5）。

用于硫取代磷酸-寡核苷酸分析的最常见的离子对系统是用HFIP缓冲的相对亲水性TEA。这似乎与前几节中给出的结果相矛盾。据报道，TEA/HFIP系统中离子分离的改进是由于TEA在HFIP溶液中的低溶解性增强了其在固定相上的吸附。这一假设解释了为什么TEA+HFIP缓冲区与10mM TEAA相比提供了显著更高的n和n-1聚体分离度（见图4）。全氟醇对寡核苷酸离子对-反相-LC分离的影响已由多个小组进行了研究，但尚未完全了解。因此，作者研究了5mM TEA+50mM HFIP系统用于分离硫代磷酸酯寡核苷酸。图5显示，具有50 mM HFIP缓冲系统的5 mM TEA提供了可接受的n和n-1、…n-x 硫取代磷酸的保留和分离。作者还研究了同一序列的21个碱基与不同数目的硫取代磷酸键的分离。10 mM TEAA和5 mM TEA+50 mM HFIP缓冲系统的比较如图6所示。后一种缓冲系统有效抑制了非对映体分离，导致窄峰（图6）和比10 mM TEAA更高的分离度。作者认为，抑制非对映体分离是TEA/HFIP系统中硫取代磷酸-寡核苷酸分离改善的主要原因（见图4和5；表S13）。用HFIP缓冲系统分离硫代磷酸酯寡核苷酸的烷基胺（TEA除外）的系统研究尚未发表。作为下一步，作者计划通过评估HFIP和其他含不同烷基胺的氟醇作为离子对对硫取代磷酸键位置和数量不同的非对映体分离和解析的影响来扩展这项工作。

结 论

在本研究中，作者研究了离子对（离子对）系统及其对离子交换反相液相色谱中硫代磷酸根离子分离的影响。研究了两种浓度（10mM和100mM）下的八个离子对系统。离子对系统的性质和浓度对硫取代磷酸-寡核苷酸的保留、非对映体分离有很大影响。

表2总结了用于特定应用的推荐色谱系统。作者观察到烷基胺链长（疏水性）与离子对系统通过静电相互作用促进离子保留和分离的能力之间存在强烈关系。当使用更疏水的烷基胺时，需要更高的ACN浓度来洗脱寡核苷酸。这导致抑制寡核苷酸与C18 固定相的疏水相互作用，并相应抑制硫代磷酸酯寡核苷酸的非对映体分离度。虽然这是一个普遍趋势，但对于非常强的离子对系统，如OAA和DHAA，观察到硫取代磷酸-寡核苷酸非对映异构体的部分分离。这表明静电相互作用在非对映异构体分离中的作用不能完全忽略。对于疏水性更强的离子对系统，观察到两种测试分析物的不同长度的多聚物具有更高的分离度，但对于DBAA观察到最高分离度。作者还观察到，对于所有研究的离子对系统，相同序列的离子分离和硫取代磷酸键的不同程度/位置有关。这可能有助于硫取代磷酸离子的质量控制和部分氧化杂质的分离。本文简要比较了TEA/HFIP系统和TEA醋酸盐系统。

TEA/HFIP 流动相具有很强的抑制非对映体分离的能力，同时提供了n和n-1聚体的良好分离度。这项工作可以作为硫取代磷酸-寡核苷酸方法开发的指南，例如为特定寡核苷酸应用选择合适的离子对系统。

1、机理较为复杂，若未能很好理解，可能会出现用反的情况（有的法定标准也有同样问题，甚至阴阳离子对试剂都加进了流动相）；

2、离子对试剂浓度不够导致方法无法重现，保留和峰型不稳定的情况，起始浓度一般理论上建议至少覆盖固定相1/3的表面积（大概浓度估算可参考《现代液相色谱技术导论》第3版第7章图7-14）；

3、pH选择不合理，流动相缓冲能力不足导致方法不稳定（样品均为含酸碱基团的化合物），有的标准方法甚至在化合物根本无法解离的pH范围内使用离子对色谱。

4、灵敏度较差，特别是在使用接近末端吸收的波长时，有关物质的梯度洗脱是无法使用的，除非作为含量测定的方法可采用。

5、不同厂家不同类型的离子对试剂质量参差不齐（曾对比过国内外不同厂家的同一种离子对试剂，鬼峰出峰不一且无法避免），虽然都使用的是色谱纯试剂。

6、大部分情况下不能使用捕集柱（会将离子对试剂吸附影响分离和保留），但现在市面上有阳离子对色谱专用的捕集柱可使用。

7、使用离子对色谱可能使色谱柱被改性影响其他项目的使用，尽量专项专柱。

8、平衡时间较长，进样前需要足够的时间使得离子对体系与色谱柱之间达到平衡（一般建议至少进3针或以上空白），否则可能引起保留时间漂移。

9、因离子对体系与常用的溶剂组成相差较大，易引起溶剂效应，一般建议使用流动相作为溶剂。

10、部分用于离子对的色谱柱柱效下降较快，特别是铵类离子对试剂（如四丁基氢氧化铵或四丁基溴化铵），即使在常规流动相pH7.0~8.0（或更低）的体系内仍然如此，离子对浓度越高，pH越高柱效下降的越快（主要表现在色谱峰分叉、前延或拖尾），多个品牌的色谱柱均有类似情况，但惰性封端更好的填料能略好一些，建议在使用这一类流动相时每日序列结束后使用甲醇-磷酸盐（100mmol/L）（50：50）进行冲洗，也可根据不同项目调整冲洗液的pH、有机相比例和盐浓度，可适当延缓柱效下降的情况。