项目文章 | Nat Genet发表中山大学肿瘤中心RNA m6A形成与DNA去甲基化结合介导的染色质可及性和基因转录的调控机制

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●发表期刊：Nat Genet

●影响因子：41.3

●发表时间：2022.09

中山大学肿瘤中心郑健团队、美国希望之城国家医学中心贝克曼研究所陈建军团队与中山大学肿瘤中心林东昕团队合作，在Nature Genetics 杂志发表题为“RNA m⁶A regulates transcription via DNA demethylationand chromatin accessibility”的研究论文，迈维代谢有幸提供了核酸修饰检测服务。

转录调控整合了染色质可及性、转录因子和表观遗传修饰，是建立和维持细胞特性的关键。不同表观遗传修饰之间的相互作用及其对转录调控的贡献仍然难以捉摸。在本文中，研究者发现 METTL3 介导的RNAn6 -甲基腺嘌呤(m⁶A)的形成导致正常细胞和癌细胞中邻近基因组位点的DNA去甲基化，这是由m⁶A阅读器FXR1和DNA5-甲基胞嘧啶双加氧酶TET1之间的相互作用介导的。在识别RNA m⁶A后，FXR1招募TET1到基因组位点去甲基化DNA，导致重新编程的染色质可及性和基因转录。因此，本文描述了RNA m⁶A形成与DNA去甲基化结合介导的染色质可及性和基因转录的调控机制，强调了RNA m⁶A与DNA修饰之间的串扰在生理和致病过程中的重要性。

为了探索RNA m⁶A和DNA 5mC之间潜在的相互作用，研究者首先系统地分析了公共数据集。通过比较基因组位置，发现大量的m⁶A连锁位点与CpGs重叠，但RNA m⁶A和DNA 5mC水平呈负相关。由于m⁶A可以调节染色质状态，推测RNA m⁶A也可能调节DNA 5mC，从而影响染色质可及性。为了验证这一假设，研究者使用酶联免疫吸附试验(ELISA)和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)在METTL3沉默或未沉默的细胞中测定了DNA 5mC水平。METTL3的缺失导致DNA 5mC水平和5mC/C比值显著增加(图1a,b)。另一个核心m⁶A甲基转移酶METTL14的缺失也会导致DNA 5mC水平的显著增加，而沉默m⁶A去甲基化酶FTO的结果则相反。METTL3缺失的细胞中DNA 5mC水平的增加可以通过野生型METTL3的异位表达来挽救，但METTL3突变体不能挽救(图1b)。这些结果表明，METTL3、METTL14和FTO可以改变DNA 5mC水平。

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图1 

由于DNA去甲基酶TET1/2/3可以使DNA 5mC去甲基化，研究者研究这些酶是否在RNA m⁶A和DNA 5mC相互作用过程中发挥作用。首先分析TET1/2/3和METTL3和RNA m⁶A测序的公共染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)，发现只有TET1与METTL3重叠良好，接近m⁶A峰值，这表明可能是TET1参与了RNA m⁶A和DNA 5mC的相互作用。

然后研究者使用CUT&Tag检测细胞中METTL3和TET1的染色质占用情况。综合分析显示TET1结合水平与m⁶A水平呈正相关和重叠(图2a,b)。TET1中>65%的靶基因具有m⁶A(图2c)，METTL3的CUT&Tag信号强度与TET1的信号强度呈正相关(图2d)。大多数TET1(97.1%)与METTL3共定位(图2g)，局限于METTL3峰的中心(例如，AKIRN2和THEM6)(图2f)。在分析公共小鼠胚胎干细胞(mESC)数据时也得到了类似的结果。此外，研究者还发现METTL3敲除后的食管鳞癌(ESCC)细胞中TET1染色质结合水平大幅下降，而野生型的METTL3可以挽救TET1染色质结合水平，但突变型的METTL3不能挽救TET1染色质结合水平;减少的结合倾向于位于m⁶A峰的中心(图2f)。验证试验再次表明，m⁶A修饰的基因在METTL3敲除后显著减少TET1结合，而野生型(而非突变型)METTL3的特异表达可以挽救TET1结合;相比之下，阴性对照基因CNGA4的TET1结合水平没有改变，其RNA中没有m⁶A修饰。

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图2 

由于RNA m⁶A是协同转录形成的，而TET1在转录过程中与RNA聚合酶II(Pol II)相关，研究者测试了m⁶A的形成是否协同转录招募TET1。通过使用CUT&Tag检测PolII的定位，发现82.9%的TET1结合位点被PolII靶向(图3a)，TET1定位在PolII的中心(图3b)。PolII抑制剂处理的细胞TET1染色质结合明显减少(图3c)。METTL3的耗尽也导致TET1染色质结合以m⁶A甲基转移酶依赖的方式减少(图3d)。这些结果表明，METTL3形成的RNA m⁶A是TET1以协同转录的方式结合靶染色质所必需的。

Westernblot分析显示TET1和FXR1之间存在直接的独立于DNA和RNA支架的相互作用，而其他核蛋白则没有相互作用(图4b)。大多数FXR1结合位点与m⁶A峰的中心重合(图4d)。

研究者还分析了敲除FXR1和未敲除FXR1的细胞中整体DNA 5mC水平和TET1结合位点的CUT&Tag，结果表明FXR1的缺失显著增加了DNA 5mC水平，降低了TET1结合位点，FXR1的恢复表达可以挽救DNA 5mC水平(图4i,j)。

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图3 

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图4

为了阐明RNA和DNA之间影响基因表达的染色质调控相互作用，首先检测了METTL3、TET1或FXR1敲除对转录组调控的影响。RNA测序结果显示，许多差异表达的RNA在METTL3、TET1或FXR1缺失的细胞中重叠(图5a)。利用转座酶可达染色质测序(ATAC-seq)，以检查差异表达是否与染色质状态有关，发现敲除METTL3、TET1或FXR1后，细胞染色质可及性发生显著改变;这些变化包括可及性的获得或丧失，且大多数发生在内含子或基因间区域。此外，TET1或FXR1敲除可及性与METTL3敲除相似，表明在研究者的模型中，METTL3、FXR1和TET1具有协同作用(图5b)。

最后，研究者想在人类原始组织中验证这些发现。研究者对8对ESCC和正常组织样本进行了m⁶A测序和WGBS。研究者发现ESCC的DNA甲基化水平明显低于相邻正常组织，但m⁶A水平高于正常组织(图6a,b)，这表明RNA m⁶A和DNA 5mC修饰可能是相互排斥的。大多数RNA m⁶A峰(64.7%)的CpGs在其区域的±2000bp内，65.4%的RNA m⁶A峰的水平与各峰范围内CpGs的甲基化水平呈负相关(图6c)。

METTL3的异位表达恢复了m⁶A水平，并增加了TET1和FXR1与METTL3敲除后减少的相邻区域的结合。研究者观察到TET1或FXR1RNA水平与DNA甲基化水平之间存在更强的相关性，这些CpGs的甲基化水平与m⁶A峰值呈负相关，而与m⁶A峰值不相关的CpGs则相反(图6d,e)。在ESCC中鉴定到与RNA m⁶A高甲基化和DNA低甲基化相关的基因，这些基因的功能注释显示在大量的经典癌症相关通路中富集(图6g)，这说明RNA m⁶A和DNA 5mC之间的串扰可能在ESCC发育相关基因的异常调控中发挥重要作用。

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图5

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图6

迈维代谢开发并建立了一种通过液相色谱-串联质谱定量分析DNA和RNA修饰碱基的方法，这是目前整体核酸修饰分析中唯一能够对极低含量修饰碱基准确定性定量的方法，可检测59种核酸修饰。

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