蛋白质组学专题 | 一文读懂蛋白质组学研究策略及研究内容

2022-10-11 05:23:23, 小迈 武汉迈特维尔生物科技有限公司


PART

01
蛋白质组学研究策略

蛋白质组学中,蛋白质的定性检测有两种思路(图1):Bottom-up和Top-down。Top-down是指从一个完整的蛋白出发,在质谱中进行碎片化处理,通过对碎片分子的检测,推导出蛋白的序列。在使用中真正占绝大多数是Bottom-up方法,也就是我们常说的shotgun方法,它充分利用了蛋白质自身的特点:可以被特定的酶在特定的位点切断。基本思路是,先用蛋白酶把蛋白序列进行酶切,再针对酶切后的肽段进行鉴定,所以进入质谱的检测对象是肽段,再根据肽段序列推导出蛋白序列,下述的方法均属于bottom-up策略。


    

图1 蛋白质组学的两种基本研究策略


通常,蛋白质组学的技术路线包含以下几步:

    

图2 bottom-up策略的基本流程


●样本预处理蛋白质组学的研究对象往往是各类生物样本,如细胞系(293T,Hela等)、组织(肝、肾脏等)、微生物菌体或者各类体液(尿液、血清/血浆等)。拿到生物样本后,首先需要对样本进行前处理,其目的是为了尽可能多的提取出样品中的蛋白质。在这一步,不同的样本类型、不同的实验目的所使用的方法也有所不同,具体情况将在后续详细介绍;

●蛋白酶解。用序列特异性的酶(如Trypsin、Glu-C,Lys-C等),对蛋白进行酶切,将蛋白混合物酶解成肽段混合物;

●肽段离线预分级使用HPLC(高效液相色谱)对肽段混合物进行预分级,将一个样品的肽段混合物分成多个馏分(fraction)。肽段预分离是根据肽段的亲疏水性逐步分离的过程,是为了肽段混合物进入质谱前降低样品复杂度,从而鉴定出更多的肽段/蛋白。在一般的蛋白质组实验中,人们通常将样品先分级成10-30个馏分,再分别上质谱。当然,有些样品,由于其蛋白复杂度不高,也可以不用分离。

●肽段在线分离(nano-HPLC酶切后的肽段进入nano-HPLC(纳升级高压液相色谱),这也就是我们常说的LC-MS中的LC,肽段会因为在色谱柱填料上的保留时间的不同,得到预分离,使样品中的肽段在一定时间范围内先后进入质谱并得到检测;

●质谱解析。分离后的肽段,首先经过质谱的软电离离子源(主要有ESI和MALDI两大类),将中性肽段电离并形成带正电荷的肽段离子,然后送入质谱的质量分析器,质量分析器会将不同质荷比的肽段离子分离并记录,得到一级谱图。另外,目前主流的质谱仪都是所谓的串联质谱仪,即肽段母离子进入质量检测器后,质谱仪每次扫描会自动选择信号强度较高前20-40个母离子继续碎裂,将肽段母离子碎裂成更小的片段,然后对碎片离子的质荷比和强度进行记录,从而得到二级谱图。以上是一种叫做数据依赖型采集模式的基本工作过程。关于质谱仪的工作原理会在本系列中的其他文章中详细介绍;

●数据解析生物样本(即上述提取好的多肽混合物)经过质谱仪检测,会记录对应的肽段母离子(即肽段离子)和二级子离子(即肽段的碎片离子)的质荷比、信号强度和保留时间。使用蛋白质组搜索软件对质谱图进行自动化的分析,可得到肽段序列和蛋白序列信息。自此,就完成了蛋白质的定性。对于定量蛋白质组学,主要借助质谱仪记录的母离子或碎片离子的信号强度来推断肽段/蛋白质的表达水平以及变化趋势。对于质谱数据解析,目前的基本策略是使用由基因组测序数据推断来的编码基因所转录、翻译而来的蛋白,和质谱数据进行比对的策略实现蛋白质组鉴定。关于质谱的数据解析原理将在本系列中单独详细介绍。

PART

02
蛋白质组学的主要研究内容

在本文前面章节有提到,蛋白质组学的主要目的研究蛋白质组的种类、表达量变化、翻译后修饰、蛋白-蛋白相互作用以及其参与的生物功能(图3),下面分别介绍:

    

图3 蛋白质组学主要研究内容


2.1 蛋白质组鉴定

顾名思义,蛋白质的鉴定即对给定生物样本的蛋白质成分进行大规模鉴定。理论上,蛋白质组学技术一次可以鉴定数千种甚至上万种蛋白。当然,这也取决于样品前处理方法以及质谱仪的灵敏度和分辨率。


对于蛋白质组定性分析,方法策略比较简单,利用本文上一节提到的几个步骤即可完成。当然,根据需求不同,定性分析也分多钟情况。比如,如果想研究血浆/血清等体液类物质,往往需要考虑去除高丰度蛋白,以避免高丰度蛋白的存在对低丰度蛋白的质谱检测受到影响;如果想研究某种翻译后修饰蛋白,由于翻译后修饰蛋白的表达量往往极低,那么在样品前处理时,需要对发生特定修饰的蛋白(一般先对提取的总蛋白酶解成肽段,然后再对肽段富集)事先富集出来,然后再上质谱检测.


2.2 蛋白质组定量分析

从生物体生命的直接执行者——蛋白质的角度研究生物的各种生命现象及各种疾病、病理已经成为生物学发展的趋势。而这些研究往往离不开对细胞、组织或器官中蛋白质的种类和表达水平的研究,以及对处在不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究。这些研究离不开对蛋白质的鉴定和定量。因此,蛋白质组学定量技术在进入21世纪后得到了迅速发展,各种定量技术应用而生。如最早提出的基于谱图计数法的label-free定量、基于提取的色谱离子流图峰面积的label-free定量、iTRAQ/TMT标记定量技术、SILAC定量技术,以及最近提出的数据非依赖型采集模式的SWATH/DIA定量。


首先需要明确蛋白质组学中定量的含义。在蛋白质组学中,一般意义上的“定量”均指相对定量,即对某种蛋白在不同样品中的表达量变化的测定。比如,通过比较胃癌的癌旁组织和癌症组织的蛋白质组数据,可以获得癌症组织和癌旁组织相比,蛋白质的表达量变化信息,此研究的目的就是为了找到与胃癌发生相关的蛋白质。综上,在蛋白质组学中提到的定量,一般情况是指相对定量。


在基于质谱的定量蛋白质组学策略中,主要原理是:样品中的肽段含量与质谱检测到该肽段的信号强度成正比,因此,可以用肽段的信号强度来表征肽段含量,进而推断蛋白的表达量并计算每种蛋白在不同样品中的含量比值(即表达差异倍数)。


2.3 翻译后修饰蛋白质组学

蛋白质翻译后修饰(posttranslational modification, PTMs)是细胞实现快速、可逆调控蛋白质功能的关键途径。哺乳动物中超过50%的蛋白质需经PTMs才能实现其特定的生理功能。目前Uniprot蛋白质数据库已收录超过450种PTMs蛋白质的类型,其中最主要的PTMs包括磷酸化、赖氨酸乙酰化、泛素化、糖基化等。PTMs蛋白质组学的研究流程与经典蛋白质组学相似,但由于PTMs的蛋白质相对丰度较低,在细胞内处于动态变化中, 并且修饰基团与氨基酸残基间的共价键较易断裂,所以PTMs蛋白质组学的研究需要更加有效的分析技术。其技术方法一般包括样品前处理肽段分级含修饰基团肽段的富集质谱分析生物信息学分析等步骤。


翻译后修饰蛋白质组学的研究内容主要包含在两点,一是鉴定蛋白序列中发生了翻译后修饰的氨基酸位点,二是对发生了PTMs的位点做相对定量分析。通过前者,可以精确鉴定出某一蛋白上发生了特定翻译后修饰的氨基酸位置,后者可以通过比较不同样本的翻译后修饰表达水平,评价其生理学、病理学功能。


2.4 相互作用蛋白质组学

生物体的生理功能主要由细胞中的蛋白质控制和调节。其中,多数蛋白质是通过与配体结合或是作为蛋白质复合物的一部分参与细胞的代谢过程。因此,研究蛋白质相互作用是理解生命活动的基础。


传统的蛋白质相互作用研究方法需要研究者根据已有研究基础和较深入的研究背景,通过一定的摸索或积累,对可能存在的相互作用进行准确预测,然后对预测的相互作用进行验证。其通量小,研究效率低,获得的信息量有限。


相互作用蛋白质组学是一种基于质谱技术对蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-药物/小分子化合物相互作用进行大规模定性或定量研究的蛋白质组学方法。采用免疫沉淀(IP)或pull-down等亲和分离手段,将能够与特定分子结合的蛋白质复合物进行分离,然后利用蛋白质组学大规模定性或定量的优势进行蛋白质复合物解析,是研究蛋白质与生物分子或药物之间相互作用的强大工具。


相比于传统的蛋白质相互作用研究方法,基于质谱技术的相互作用蛋白质组学的大规模研究具有以下优势

1.大规模的开放性研究,可更为高效的发掘和鉴定相互作用蛋白;

2.信息输出规模大,能够在网络层面上全面地描绘和反映蛋白质互作关系;


开放性的研究和大规模信息,可能带来更为创新的发现。


本期内容就介绍到这里。下一期将介绍几种主流技术的原理和优缺点,敬请期待~~


ART

03
科研延伸

(1)迈维4D蛋白质组学

●蛋白质检出数量多、样本检出稳定性高


●定性重复性高,更准确

●定量稳定性高,可重现性高

(2)迈维Olink蛋白质组学

近两年Olink蛋白质组频发高分文章,并凭借其超敏、微量、有利于中低丰度蛋白检出等优势,迅速火爆医学与临床研究领域。为提供创新的蛋白质组学服务,迈维代谢紧跟科研前沿,提供Olink蛋白质组学检测服务。



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