一天四篇Nature | Incucyte助力罕见病研究

2022-09-21 07:35:02, 陈老湿德国赛多利斯集团

I型干扰素（IFN-1）病是近年来概念较新的一组疾病，属于免疫缺陷病中的自身炎症性疾病，以体内I型干扰素过度激活表达造成炎症损伤为突出特点，表现为不明原因的全身性炎症，不易诊断，发病率低，并且没有好的治疗方法^[1]。Aicardi-Goutières（艾卡迪-古特雷斯，简称AGS）综合征便是其中之一。AGS由1984年首次提出，是一种主要影响大脑、免疫系统和皮肤的罕见遗传疾病，且无法治愈。目前已发现7种致病基因：TREX1、RNASEH2A、RNASEH2B、RNASEH2C、SAMHD1、ADAR以及IFIH1。

基因缺陷疾病最根本的治愈方法是基因编辑疗法，纠正突变的基因，但由于其存在脱靶效应、安全性质疑、伦理问题等，对全身性基因缺陷疾病进行基因编辑仍不现实，亟需针对AGS的发病机理以及分子机制的进一步研究，以设计生产出对应的治疗药物。

Nature

2022年7月20日，Nature期刊同时刊登四篇文章均用到Incucyte® 实时活细胞成像分析系统！其中三篇同时报道了对AGS综合征罕见病的重大研究进展，发现了一种ADAR1突变型AGS综合征的全新发病机制，为治疗提供了新的靶点和思路。这三篇文章具体报道了什么，又是如何应用Incucyte® 的呢？

下面我们以德国科隆CECAD 研究中心的Manolis Pasparakis教授团队（第一作者为焦会朋博士和Laurens Wachsmuth博士）发表的其中一篇题为“ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1”为例详细讲一讲研究的思路以及Incucyte® 在基础研究中的应用^[2]。

研究背景

ADAR1突变是病因之一。ADAR1蛋白有两种亚型，核内表达的结构性p110及胞质内表达的含有Zα区域的p150，p150含有1个Zα结构域、1个脱氨酶结构域和3个dsRNA结合结构域。脱氨酶结构域催化dsRNA的A-to-I编辑，Zα结构域特异性识别和结合左旋核酸（Z-nucleic acids，Z-NAs）^[3]。大部分的患者编码该区域的序列发生点突变导致人ADAR1中193位的脯氨酸变为丙氨酸^[4]，且模拟AGS患者小鼠模型表现出MDA5-MAVS依赖的致病性IFN-1应答^[5]。这就表明ADAR1 Zα结构域同Z-NAs的相互作用能够抑制致病性IFN-1应答。

图1ADAR1结构图

研究结果

为了模拟人类ADAR1突变诱发的AGS患者，作者首先构建ADAR1 Zα结构域（N175D/Y179A）突变的杂合子小鼠（Adar1^mZα/-），该小鼠表现产后致死，伴随红细胞生成缺陷、肠道细胞大量死亡和不同组织中IFN-1应答的上调，且MAVS-/-完全逆转AGS的病理学表型，说明依赖于MAVS信号通路，这与之前的研究成果一致。

ZBP1是哺乳动物中除ADAR1外唯一含有Zα结构域的蛋白，是一个干扰素诱导表达的蛋白，在调控细胞死亡、抗病毒反应、炎症反应和组织稳态过程中发挥重要作用^[6]。作者进一步发现ZBP1缺失能够不完全抑制上述病理表型：产后致死、红细胞生成缺陷以及肠道和肾脏病变等。而表现出AGS疾病表型的另一种Adar1杂合及Mavs杂合小鼠，也能被ZBP1敲除不同程度地逆转。综上所述，ZBP1是促进Adar1^mZα/-小鼠致病性IFN-1应答的关键蛋白。

在这部分结果中，使用的都是半敲小鼠，在纯合敲除小鼠中，发现大约40%的 Adar1-/- Zbp1-/-Mavs-/-小鼠存活到成年期。探究ZBP1-RIPK3的作用在Adar-/-小鼠中的作用时，作者分离小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），与Mavs-/- MEFs相比，少量蛋白质翻译抑制剂CHX处理IFNγ 预刺激的细胞（刺激ZBP1表达）导致Adar1-/-Mavs-/-中的细胞死亡增加，ZBP1敲除阻止了死亡表型（表1）。说明ZBP1-RIPK3依赖性信号促进Adar1-/-Mavs-/-小鼠的MAVS非依赖性病理。

表1Incucyte® 统计的实时细胞死亡的信号强度

那ZBP1是如何促进Adar1 ^mZα/-小鼠IFN-1应答的呢？Zα结构域可以识别左旋DNA和RNA，是否是通过特异性结合某种核酸实现的呢？

TREX1突变诱发的AGS小鼠模型（Trex1-/-），是通过自身DNA积累激活cGAS-STING，诱发I型干扰素上调和心肌炎的^[7,8]，且ZBP1确实对于TREX1突变导致的表现没有任何影响，这表明ZBP1可能特异性识别ADAR1突变诱发的左旋RNA的积累来促进病理表型的。RNA高通量测序（RNA-seq）发现小鼠内源性逆转录元件表达的上调和A-to-I编辑的下调，dsRNA在体内的积累，为ZBP1的激活提供了特异性的配体。ZBP1 Zα结构域的突变能够抑制Adar1^mZα/-小鼠的病理表型，证实ZBP1通过结合小鼠中积累的内源性Z-RNA促进疾病表型。

ZBP1结合Z-RNA以后又是如何激活下游信号通路，调控IFN-1应答，进而促进疾病表型的呢？

之前的研究表明ZBP1可以诱发的RIPK3依赖的FADD-Caspase-8介导的细胞凋亡（apoptosis）、MLKL介导的程序性细胞坏死（necroptosis）以及RIPK1介导的促炎反应^[9]，作者对已有的研究结果进行验证，发现Ripk3-/-、Mlkl-/-、Fadd-/- Mlkl-/-、Fadd-/- Ripk3-/-和Ripk1^mR/mRMlkl-/-等突变都无法逆转Adar^mZα/-小鼠的病理表型，这表明ZBP1促进致病性I型干扰素应答与已有的信号通路无关，具体机制有待于进一步研究。

结论

在这篇文章中，研究人员发现ZBP1是促进ADAR1 Zα结构域突变的半合子小鼠（Adar1 ^mZα/-）引起的致病性I型干扰素应答的关键分子，为治疗提供了新的靶点，并且提出存在一种不依赖于细胞死亡的全新致病机制的可能。

同样，来自华盛顿大学的Andrew Oberst团队发表题为“ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology”的文章^[10]，他们也发现ADAR1致病是由ZBP1激活驱动的，但ZBP1激活导致细胞死亡是由于PIPK3和MLKL的磷酸化，且依赖于caspase 8，这与焦博士的结论有所不同。

在研究下游通路的过程中，作者使用Incucyte® 对密集时间点的实时细胞死亡情况进行检测，提供了可靠的数据支持。下面为文中利用Incucyte® 做出的结果：

为了探索ADAR1改变激活的ZBP1下游通路，用半胱天冬酶抑制剂zVAD处理它们会导致ZBP1依赖性RIPK3磷酸化和细胞死亡，加入PIPK3磷酸化抑制剂GSK843逆转细胞死亡表型（图2），证明Adar P195A/p150null细胞对ZBP1依赖性坏死性凋亡敏感。

图2Caspase抑制剂zVAD处理8小时后（激活PIPK3依赖性细胞死亡），使用Incucyte® 测量细胞死亡。

同时ADAR1的缺失也激活ZBP1介导的caspase-8依赖的凋亡和MLKL依赖的坏死性凋亡。为了证明ZBP1与RIPK1相互作用激活caspase-8依赖性细胞凋亡，作者设计了一种直接巧妙的激活ZBP1的还原系统，用衍生自蛋白质FK506的串联诱导型二聚化结构域替换ZBP1的ZBD，使用可渗透细胞的小分子B/B激活。实验表明，尽管RIPK3促进 ZBP1 依赖性细胞凋亡，但在没有RIPK3的情况下，ZBP1仍然可以驱动caspase-8依赖性细胞死亡反应（图3）。

图3 Incucyte® 检测死亡细胞比例

这还没结束，比利时的Jonathan Maelfait团队也发表一篇Nature文章“ ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation”^[11]，该文章的亮点是：ADAR1改变导致dsRNA形成，与ZBP1结合自激活，而ZBP1激活会导致caspase-8依赖性细胞凋亡和MLKL介导的ADAR1缺陷细胞的坏死性凋亡，进而导致胚胎致死表型。

为了确定哪些信号通路导致ADAR1缺陷细胞死亡，用IFNα处理原代小鼠肺成纤维细胞以诱导ZBP1表达，为了排除自发MDA5和MAVS或TNF信号传导对细胞存活的混杂影响，加入TNF中和抗体。用IFNα和蛋白质合成抑制剂放线菌酮 (CHX) 刺激 ADAR1 缺陷型成纤维细胞，增强TNF诱导的细胞死亡，诱导ZBP1介导的细胞死亡（图4）。结果证明ZBP1激活导致RIPK3的募集，从而诱导RIPK1-FADD-caspase-8介导的细胞凋亡和MLKL介导的坏死性凋亡的平行途径。

图4 Incucyte® 实时检测原代小鼠肺成纤维细胞死亡

为了测试dsRNA结构是否能刺激ZBP1，研究者将来自NICN1和BPNT1 mRNA的3''UTR的转录Alu-Alu杂合体体外转染到表达人ZBP1的HT-29细胞中。两种Alu-Alu杂交体都强烈诱导ZBP1依赖性细胞死亡，这依赖于完整的ZBP1 Zα结构域，并且可以被zVAD-FMK抑制，并且与GSK’84联合对细胞死亡的抑制效果更强（图5）。

图5 dsRNA诱导ZBP1突变细胞死亡，Incucyte® 检测死亡阳性细胞比例

这三篇Nature文章同时揭示了ADAR1改变导致AGS综合征是由于ZBP1的激活引发的全新机制，尽管研究后续信号通路时结论有所不同，但都进一步支持ZBP1是哺乳动物dsRNA的感受器的观点。

除了以上三篇，同一天还有第四篇Nature文章“Mechanisms of APOBEC3 mutagenesis in human cancer cells”，来自美国的MIT和哈佛大学博德研究院John Maciejowski团队。研究人员建立了单碱基置换（single-base substitutions，简称SBS）特征标签与人类肿瘤细胞基因组上内源性APOBEC3之间的联系^[12]，在这篇文章中，肿瘤细胞的增殖能力强，可以进行长时间的观察，研究者利用Incucyte® 连续监测了20天（480h!!!）细胞的增殖情况（图6）。

图6 Incucyte® 以汇合度(Confluence)实时检测REV1敲除后细胞的增殖

Summary

总而言之，在上述研究中体现出Incucyte®长时程活细胞成像与分析系统独特优势：

自动检测，提升实验效率：满足密集时间点以及长时间监测的需求，一次实验得到大量数据，解放人力，是从事细胞研究不可或缺的工具；

分析简便，提升数据质量：软件采集及分析模块配合荧光检测试剂，得到高度可靠的数据。实时检测整个细胞死亡/凋亡曲线，在细胞死亡状况较为接近的情况下，仍然在大量数据的前提下得到确切的结论；

6板位设计，多实验同步开展：内设6个板位，可以分别独立设置检测程序，满足6组不同实验或多人实验同时检测的需求。

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[1]Cetin Gedik K, Lamot L, Romano M, et al. The 2021 European Alliance of Associations for Rheumatology/American College of Rheumatology points to consider for diagnosis and management of autoinflammatory type I interferonopathies: CANDLE/PRAAS, SAVI and AGS[J]. Annals of the Rheumatic Diseases, 2022, 81(5): 601–613.

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