新颖的绿色分析化学策略 – 温控介导的天然低共熔溶剂微萃取与实时直接分析质谱联用

《华尔街日报》：借助高新质谱检测技术，精准打击木材盗伐

NEWS

近日，中国检验检疫科学研究院马强首席专家团队在国际学术期刊《Journal of Agricultural and Food Chemistry》（中科院一区，IF 5.895）发表了题为“Natural Deep Eutectic Solvent-Based Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Coupled with Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry: A Green Temperature-Mediated Analytical Strategy 的文章。本推送编译节选自原文。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.jafc.2c03561

邻苯二甲酸酯类（DPP、BBP、DCHP、DBEP、DEHP、DNOP、DINP、DNP）及其同位素内标购自 Dr. Ehrenstorfer。黄曲霉毒素 B₁（AFB1）购自 Sigma-Aldrich。黄曲霉毒素B₂（AFB2）、黄曲霉毒素 G2（AFG2）和黄曲霉毒素 M1（AFM1）购自上海阿拉丁。

食品模拟物用于模拟食品接触材料的化学成分迁移。取 0.5 g 样品（切块约1 cm²）加入10 g 含5 μL 内标混合液（浓度为20 μg/mL）的10%（v/v）乙醇溶液、1g 氯化钠和100 μL 薄荷醇和1,4-丁二醇的摩尔比为1:3的疏水性天然低共熔溶剂。涡旋萃取5 min，形成分散性良好的混浊溶液，在4℃下离心5 min，使疏水性天然低共熔溶剂实现相分离和固化。

此外，将氯化胆碱与1,4-丁二醇按摩尔比1:2混合制备成亲水性天然低共熔溶剂，用于食用油中黄曲霉毒素的萃取。取0.5 g 食用油样品，加入2 μL 浓度为10 μg/mL 的 AFM1内标溶液、0.5 mL 正己烷和100 μL 亲水性天然低共熔溶剂。混合物涡旋1 min 后在4°C 下离心5 min，使亲水性天然低共熔溶剂实现相分离和固化。

用镊子将固化的天然低共熔溶剂提取物夹放在74目12位金属筛网之间，固定在 DART 采样导轨上。加热的 DART 气体（氦气）融化低共熔溶剂并解吸目标物，继而发生原位电离和后端 HRMS 高分辨质谱检测，自动连续处理和分析12个样品。DART 参数设置如下：氦气流量 3 L/min，疏水低共熔溶剂的加热温度为 400℃、亲水低共熔溶剂的加热温度为 500℃。

QE Focus 质谱仪在正离子模式下进行数据采集，毛细管温度为320℃，S-lens 射频水平为 50%。分别采用一级全扫描/数据依赖二级扫描模式（Full MS/dd-MS²）和平行反应监测（PRM）采集模式，对邻苯二甲酸酯和黄曲霉毒素进行分析。在全扫描模式下，仪器参数设置为：扫描范围 m/z 200~600，分辨率70000，自动增益控制（AGC）目标值为 1×10⁵，最大注入时间100 ms。dd-MS² 扫描模式设置如下参数：分辨率为17500，AGC 目标值为1×10⁵，最大注入时间100 ms，隔离窗口1 m/z，归一化碰撞能量（NCEs）为10%、20%和30%。PRM 采集模式根据包含黄曲霉毒素前体离子的指定包含列表和以下参数获取 MS/MS 扫描，分辨率为17500，AGC 目标值为1×10⁵，最大注入时间100 ms，隔离窗口1 m/z，NCE 为30%。数据采集和处理采用 Xcalibur 和 TraceFinder 软件。

将氢键受体（l-薄荷醇和氯化胆碱）和氢键供体（1-十二醇、1-四醇、1,2-乙二醇、1,4-丁二醇、癸酸、乳酸和尿素）以不同摩尔比混合，在80℃ 连续搅拌下加热，得到透明的均质液体。通过密度测量、傅里叶变换红外光谱、核磁共振和热重分析对制备的6种疏水和5种亲水性天然低共熔溶剂的理化性质进行了表征。更多详细信息，请参见原文。

食品在生产、储运和食用之前常与食品接触材料（如塑料）相接触。邻苯二甲酸酯是一类常见的被限制使用的增塑剂，L-薄荷醇和1,4-丁二醇混合制备的天然低共熔溶剂对其萃取率最高。其中摩尔比为1:3时提取率最佳。

实验结果还表明，当天然低共熔溶剂的体积提高至100 μL 时，萃取率逐渐升高，随后呈现降低的趋势。随着离子强度的增加，邻苯二甲酸酯的萃取率逐渐增加，在氯化钠浓度为10%时达到最大值。最优的涡旋时间为5 min。天然低共熔溶剂中1,4-丁二醇（1:1~1:3）的加入量越高，萃取率越高。然而，过量的1,4-丁二醇可能引起空间位阻，破坏天然低共熔溶剂与邻苯二甲酸酯之间的分子间相互作用。此外，基于 L-薄荷醇的天然低共熔溶剂的疏水性使其具有较高的选择性，可根据“相似相溶”的原理萃取具有非极性属性的邻苯二甲酸酯类化合物。

食用油不当的加工、运输和储存条件可导致黄曲霉毒素的产生，对健康构成巨大威胁。本研究制备了5种由氯化胆碱和尿素或1,4-丁二醇按不同摩尔比组成的亲水性天然低共熔溶剂，用于从食用油样品中萃取和富集黄曲霉毒素。

其中，氯化胆碱和1,4-丁二醇在摩尔比为1:2时得到的天然低共熔溶剂，萃取效率最高。随着天然低共熔溶剂用量从60 μL 增加到100 μL，萃取率逐渐增加，当用量为100 μL 时，3种黄曲霉毒素的萃取率可达80~100%。萃取率在涡旋时间为1 min 时达到最大值（82.1~84.3%）。黄曲霉毒素与基于氯化胆碱的天然低共熔溶剂的可萃取性可能与分子间氢键作用有关。黄曲霉毒素目标物结构中有6个或7个氧原子可接受质子，这些氧原子可能与天然低共熔溶剂的氢键供体组分（1,4-丁二醇）相互作用，从而在分散液液微萃取过程中增加它们在天然低共熔溶剂中的溶解度。

经分散液液微萃取处理后，将固化的疏水性/亲水性天然低共熔溶剂转移至传输模块中的金属筛网中。固化的天然低共熔溶剂在 DART 加热气流的作用下，迅速融化、汽化、解吸和原位电离。

对加热温度、采样速率、真空抽力、导轨距离等影响解吸和电离性能的主要参数进行了考察。邻苯二甲酸酯和黄曲霉毒素在400℃ 和500℃ 时获得了最高的信号强度。通过对分析物在0.4~2.5 mm/s 范围内的采样速率进行评估，邻苯二甲酸酯和黄曲霉毒素分别在0.8和1.0 mm/s 的轨道移动速率获得了最高的信号强度。

Q-Orbitrap HRMS 所具有的二级质谱功能使选择的前体离子和产物离子检测具有高分辨率，可提供额外的选择性，提高了检测灵敏度和准确性。这对于基于原位电离的复杂样品化学分析非常重要，因为可简化样品的前处理并避免了耗时的色谱分离。本研究考察了4种能够执行 MS/MS 扫描的数据采集模式，包括一级全扫描/二级全离子碎片扫描（Full MS/AIF）、 一级全扫描/数据依赖二级扫描（Full MS/dd-MS²）、平行反应监测（PRM）和靶向选择离子监测/数据依赖二级扫描（Targeted SIM/dd-MS²）。对结果进行比较，以达到预期的测量灵敏度和重现性，同时收集足够的数据点，以满足筛查检测及定量的需要。 

在 Full MS/AIF 和 Full MS/dd-MS² 采集模式下，质谱仪首先进行一级全扫描，其中四极杆作为滤过器，随后进行 AIF 扫描，生成所有传入前体离子或基于各种预设参数（例如包含和排除列表、质量窗口、离子丰度阈值、触发事件的最大数量）碎裂产生的产物离子。在 PRM 和 Targeted SIM/dd-MS² 两种采集模式中，四极杆作为滤过器，分离出属于特定包含列表的前体离子。分离的离子进入 C-Trap，然后被传输到高能量碰撞池（HCD）进行离子碎裂，然后返回 C-Trap，随后被注入到 Orbitrap 质量分析器进行检测。使用较窄的质量隔离窗口操作使四极杆减少了总离子束丰度，允许更长的离子收集时间，从而提高灵敏度。前体离子选择结合高分辨率碎片离子扫描也提供了更好的选择性。

在所研究的4种数据采集模式中，PRM 对邻苯二甲酸酯和黄曲霉毒素的分析灵敏度最高，其次是 Full MS/dd-MS²、Full MS/AIF 和 Targeted SIM/dd-MS²。在谱峰重现性方面，Full MS/ dd-MS² 和 Full MS/AIF 对邻苯二甲酸酯类化合物的分析优于 PRM 和 Targeted SIM/dd-MS²。然而，4种数据采集模式对黄曲霉毒素的分析无显著差异。对于8种邻苯二甲酸酯和对应的8种同位素内标物的分析，Full MS/dd-MS² 和 Full MS/AIF 能够获得比 PRM 和 Targeted SIM/dd-MS² 更多的数据点数，说明这两种模式具有更好的测量重现性。另一方面，4种数据采集模式为3种黄曲霉毒素的分析收集了相同数量的数据点。

值得注意的是，在基于原位电离质谱的多组分分析中，获得足够的数据点以进行有意义的定量积分尤为重要。在没有色谱分离的情况下，所有待测物产生的离子在同一时间段内呈现质谱信号，因此需要同时进行监测，这排除了常规时间分段方法的适用性（注：特殊分段方法适用，欲了解更多，请后台留言）。

常规时间分段方法是在色谱-质谱联用技术中常用的策略，用于处理色谱洗脱的多组分目标物分析，该方法可实现在每个预定时间段内采集更多的数据点。为了更好地平衡灵敏度、重现性和数据点数，最终选择 Full MS/dd-MS² 和 PRM 作为邻苯二甲酸酯和黄曲霉毒素分析的数据采集模式。邻苯二甲酸酯和黄曲霉毒素的 DART-Q-Orbitrap 二级质谱图如前所述。所有待测物在正离子模式下产生质子化分子，实测质量偏差均小于2 ppm，特征碎片离子的质量偏差小于2 ppm。

8种邻苯二甲酸酯和3种黄曲霉毒素的检出限和定量限分别在0.1~0.8和0.2~2.0 μg/kg 范围内。通过提取离子流图中分析物与内标物的曲线积分面积与分析物浓度的比值，绘制基质匹配校准曲线。各待测物在各自线性范围内呈现良好的线性关系，相关系数均大于0.99。采用斜率对比法研究了方法的基质效应，比较了在相同浓度范围内基质匹配校准曲线与标准溶液校准曲线的斜率，计算得到的斜率差在±30%以内。DART 离子源具有良好的结果重复性，测试浓度为100 μg/L 的6个平行混合标准溶液，相对标准偏差在1.33~8.44%之间。测试了3个加标浓度水平的回收率，平均回收率为90.32~113.70%，相对标准偏差为0.28~9.81%。该方法应用于10个食品接触材料样品（果汁盒、饮用水瓶等）和5个食用油样品（花生油、葵花籽油等）的分析，每个样品进行3次重复测试。实验结果显示，在1个食品接触材料样品中检出含有 DCHP（0.77 μg/kg）。为进一步进行比对验证，食品接触材料和食用油样品分别采用气相色谱-质谱联用法和高效液相色谱-串联质谱法进行分析检测，测得 DCHP 的含量为0.68 μg/kg，与标准方法的相对误差小于15%，验证了该方法的可靠性。通过与文献报道的邻苯二甲酸酯和黄曲霉毒素的其它分析方法进行了比较，该方法具有更短的分析时间、相似的灵敏度和更高的绿色化水平。 

根据绿色分析化学的12项原则，对该分析方法的绿色化水平进行了综合评价。如图4所示，绿色化水平通过直观的红、黄、绿颜色进行标示，反映了方法在多大程度上符合12项绿色分析化学评价标准。疏水性和亲水性天然低共熔溶剂萃取和分析方法的评分分别为0.66和0.57，表明方法的绿色化水平较高。更多详细信息，请参见原文。

扫码关注视频号