2022-09-19 22:57:17, YoYo老师 三耀精细化工品销售(北京)有限公司
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板蓝根颗粒样品基质比较复杂,客户按照20版药典方法测定含蔗糖和不含蔗糖两种板蓝根颗粒样品时,发现柱寿命短,尿苷理论塔板数较低不易达到药典要求,能明显看到第一针和第二针存在理论塔板数差异,不稳定等问题。
为此,大曹技术中心尝试对柱温、流速、梯度条件进行微调,最终能够得到良好的分离结果。
由于药典条件中梯度初始比例只有3%,为保证色谱柱的稳定使用,我们选择了能够在纯水系流动相中使用的CAPCELL PAK C18 AQ S3 色谱柱进行分析。
20版药典方法测定结果
图1 含蔗糖样品分析色谱图
图2 不含蔗糖样品分析色谱图
尿苷能够达到近10min保留时间,样品中尿苷理论塔板数分别为23440和23028,均满足药典要求的10000以上。
对于含蔗糖样品能够与基质基本分离,但在不含蔗糖样品中鸟苷附近存在基质干扰。
因此,我们尝试对柱温、流速、梯度进行微调,能够得到良好的分离结果。
分别使用35、30(药典条件)、27、25℃进行分析比较,发现鸟苷出峰位置与前后杂质出现峰序变化,其中35℃时与后面杂质分离较好,与前面小杂质峰未得到基线分离。
图3 不同柱温下的对比结果
图4 35℃柱温下单标对比结果
在35℃柱温下,我们尝试将流速由0.8ml/min调整至0.7ml/min后,能够达到鸟苷前后杂质能够得到分离,分离度分别为1.658和2.076。尿苷同样能够与其后杂质良好分离,分离度1.897,理论塔板数22137,满足药典大于10000的要求。
图5 35℃柱温下,流速由0.8ml/min调整至0.7ml/min后对比结果
在35℃柱温下,对梯度条件进行微调,将20min处有机相比例分别设定为8%、10%(药典条件)、12%进行比较,其中在12%变化时,鸟苷前后杂质能够得到分离,分离度分别为1.652和2.009,同时尿苷与后面杂质分离度也能够达到2.005,理论塔板数21176,符合药典要求。
图6 梯度调节对比结果
图7 梯度调节后局部放大图
HPLC Conditions
色谱柱:CAPCELL PAK C18 AQ S3; 4.6mm i.d.×250mm
流动相:A:水 B:甲醇
B% 3%(0min)-> 3%(3min)->12%(20min)->70%(40min)->3%(40.1min)->3%(50min)
流 速:800 µL / min
温 度:35°C
检 测:UV 254nm
进样量:5 µL
样 品:对照品:尿苷20µg/mL、鸟苷20µg/mL、腺苷25µg/mL (5%甲醇溶解)
样品:取1.4g样品,加入5%甲醇至10mL,超声5min溶解后,10000rpm/min离心5min后,过0.22µm滤膜
综上所述,对于板蓝根颗粒样品的分析,可使用CAPCELL PAK C18 AQ S3; 4.6mm i.d.×250mm色谱柱完成,尿苷的理论塔板数能够达到药典要求2倍以上,分离良好。本实验共进样30针以上,未见理论塔板数出现明显变化,稳定性良好。
此外,颗粒剂实际样品的成分复杂,特别是不含蔗糖样品中含有糊精、淀粉等不溶性辅料较多,建议在超声溶解后先进行离心后再过滤,或多次过滤直至溶液完全澄清(0.22µm滤膜),以免微量的不溶物堵塞色谱柱筛板,造成柱效的较快下降。同时色谱柱需定期使用高比例有机相进行冲洗。
同时,也由于中成药成分复杂,部分基质受到流动相条件影响大,在不同仪器系统上可能出现分离不同的情况(本实验室使用岛津20A二元高压泵系统),建议客户可根据仪器上的实际分离情况,进行梯度或柱温的微调,以获得更好分离结果。
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