往期回顾丨GC-MS/MS分析药物中的亚硝胺杂质

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测试活性药物成分（API）和药品中的亚硝胺杂质需要可靠分离目标分析物和低 ppb 范围的检测限。在此处开发的方法中，Pro EZGC 模拟软件用于在开始实验室工作之前快速确定推荐的色谱柱和条件。随后在实验室进行的测试表明，该方法在不到 10 分钟的运行时间内提供了良好的分离和低检测限。

最近，一些“沙坦”类药物被发现含有亚硝胺，亚硝胺在很低的浓度下就会致癌。这导致 FDA 要求对存在形成亚硝胺的风险的活性药物成分 (API) 和药品进行测试。FDA 已经发布了各种亚硝胺的 LC 和 GC 示例方法，要求低ppb级的检测限。对于 GC，亚硝胺杂质的分析可以使用顶空进样来分析一些挥发性较高的亚硝胺，或者直接液体进样，这对更广的挥发性范围的亚硝胺有效。虽然直接注入可能是首选，因为它比顶空更简单，但它也会将更多的基质引入系统。由于需要检测更低的浓度，加上存在基质干扰的可能性，大多数方法建议使用 GC 和三重四极杆质谱检测 (GC-MS/MS)。

在这项工作中，我们使用 Pro EZGC 色谱模拟软件首先确定了用于优化表 I 中亚硝胺分离的分析柱和条件。然后在实验室中确认了方法性能并获得了良好的线性 (R2>0.996) ，以及除了N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸 (NMBA) 和 N-亚硝基二乙醇胺 (NDELA)，其它所有分析物的低ppb级的检测限（LOD）（低于 3 ppb） 。

表I: 药物中亚硝胺杂质分析的目标化合物

标品制备：

在二氯甲烷中制备的混合亚硝胺校准标准品 (1000 ppm) 进一步用甲醇稀释，制成工作标准溶液。七点校准曲线，大多数分析物的范围是 1.25-120 ppb；NMBA 的响应比其他化合物低得多，范围是 3.8-365 ppb。N-亚硝基二乙醇胺 (NDELA) 的响应非常小，因此没有进一步测试该化合物。

色谱方法

Pro EZGC 色谱模拟软件用于选择分析柱并确定方法参数，以便在执行实验室工作之前优化亚硝胺分离。Pro EZGC 软件生成的最终色谱条件如图 1 所示。图 2 和表 II 中给出了实验室确认测试期间使用的其他参数。色谱模拟软件的使用大大缩短了实验室的方法开发时间。

表II: 离子跃迁

* 甲基苯胺是N-亚硝基甲基苯胺（NMPA）热降解的产物，苯基苯胺是N-亚硝基二苯胺（NDPHA）的降解产物。

色谱性能：

使用 Pro EZGC 色谱图模拟软件，我们轻松找到了优化的色谱柱和推荐条件（图 1）。在实验室中应用模拟给出的参数，我们证实了在非常短的运行时间（不到 10 分钟）内，在 Rxi-624Sil MS 色谱柱上产生了出色的分离效果。图 2 显示了一个标准校准点(120 ppb) 的色谱分离；获得了良好的峰形，分离度与模拟的预测一致。由于 API 和药物基质的性质差异很大，因此在这项工作中只评估了标准品；对于药物样品中亚硝胺杂质的实际分析，需要评估任何潜在基质干扰的影响。

图1: 亚硝胺分析的Pro EZGC 模拟色谱图

图2: 亚硝胺分析的实验室实际色谱图

校准和检测限：

使用线性回归，目标分析物显示出可接受的线性，r2值为0.996或更高（图3，表 III）。大部分被测化合物的检出限均低于3ppb，适用于药物中亚硝胺杂质的分析。NDELA 和 NMBA 除外，这两个化合物分别由于响应低和峰形差而无法报告。虽然两种化合物都可以通过LC进行分析，但 NDELA的LC方法也存在问题。

图3: 校准曲线

表III: 校准参数和检测限

API 或药品中的亚硝胺杂质可能会给患者健康带来负作用，因此需要新方法在批次放行前检测这些新出现的污染物。在这项工作中，使用 Pro EZGC 色谱模拟软件开发了一种优化方法，该软件确定了 Rxi-624Sil MS 色谱柱和产生最佳分离效果的分析条件。实验室中的确认测试表明，该方法提供了出色的分辨率和不到 10 分钟的快速运行时间。除 NMBA 和 NDELA 外，其它分析物均建立了良好的线性 (R2>0.996) 和低 ppb 级的检测限（低于 3 ppb）。

此外，在Pro EZGC 色谱模拟软件数据库中，Rxi-624Sil MS 色谱柱添加了胺类（amines）化合物库，包括甲胺、二甲胺、三甲胺、二乙三胺和二乙醇胺等常见的31种胺类化合物。可以使用Pro EZGC色谱模拟软件来进行这些化合物的方法开发及优化。

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