C18与PFP大PK！▏15药典头孢氨苄有关物质的分析

2022-08-29 16:45:38, YoYo老师三耀精细化工品销售（北京）有限公司

头孢氨苄（Cefalexin）为第一代口服头孢菌素，为β-内酰胺类半合成广谱抗生素，胃肠道吸收完全，口服吸收好。本品对革兰阳性菌作用较强，对革兰阴性杆菌作用较弱，对绿脓杆菌无作用。肺炎链球菌、敏感金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、淋球菌等对本品敏感。

▲ 头孢氨苄结构式

客户提供了头孢氨苄工作对照品，杂质7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸、α-苯甘氨酸、△-2-头孢氨苄对照品和80℃下破解供试品溶液所得的分离度溶液。现要求本实验室选择合适的C18色谱柱，实现头孢氨苄的有关物质分析。

在头孢氨苄有关物质分析中，流动相为高水相条件，故本实验室首先尝试能够在高水相下使用的高极性CAPCELL PAK C18 AQ S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm（柱号：A6AD04229）色谱柱，首先分析80℃破解所得分离度溶液，结果见图1。

▲图1 AQ分析80℃破解溶液及空白溶液结果

从图1中可以看到，头孢氨苄主峰保留时间为21.09 min，同主峰前后的杂质分离度分别为2.42和3.37，符合药典中基线分离的规定。进一步分析杂质对照品溶液和供试品溶液，杂质对照品溶液中杂质7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA）和α-苯甘氨酸的分离度为11.19（见图2），满足药典基线分离要求，供试品溶液中各杂质分离良好（见图3）。

▲图2 AQ分析杂质对照品溶液结果

▲图3 AQ分析头孢氨苄供试品溶液结果

客户要求考察低浓度（10 μg/mL）下，头孢氨苄与其异构体△-2-头孢氨苄的分离情况，在客户允许调整柱温（30℃~40℃）的前提下,发现柱温设定为30℃时，头孢氨苄与△-2-头孢氨苄的分离度最佳，为1.17（见图4）。

▲图4 AQ分析头孢氨苄及△-2-头孢氨苄混合溶液结果

为使客户有更多的选择，本实验室进一步尝试了大阪曹達中等极性色谱柱MGII及高碳载量的SUPERIOREX ODS色谱柱进行分析，分离效果均不及AQ柱。

进一步，尝试使用C18以外的色谱柱进行分析。

分别使用键合金刚烷基团的高极性CAPCELL PAK ADME色谱柱和键合相为五氟苯丙基、对同分异构体有良好分离能力的CAPCELL PAK PFP色谱柱进行分析。

其中，ADME色谱柱保留能力较强，因此在原梯度条件下未得到待测物洗脱，提高有机相比例亦未得到理想的分离度；

而使用大阪曹達CAPCELL PAK PFP S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm（TQAD01002）色谱柱能够达到4.84的良好分离结果结果（见图5），同其他C18柱分离度结果对比（见表1）。

▲图5 PFP分析头孢氨苄及△-2-头孢氨苄混合溶液结果

▲表1 各色谱柱分离度结果对比

（规格：S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm）

进一步用PFP色谱柱在原色谱条件下对供试品溶液，杂质对照溶液，△-2-头孢氨苄对照溶液，高温破解溶液及空白溶液进行分析。供试品溶液中各杂质能得到良好分离，主峰头孢氨苄与杂质△-2-头孢氨苄分离度为1.78（见图6），杂质对照品溶液中7-ADCA和α-苯甘氨酸的分离度为7.28（见图7）。

▲图6 PFP分析供试品溶液，空白及△-2-头孢氨苄溶液结果

▲图7 PFP分析80℃破解溶液及杂质对照溶液结果

综上实验结果，在C18系列色谱柱中，使用大阪曹達CAPCELL PAK C18 AQ S5; 4.6 mm i.d × 250 mm（A6AD04229）色谱柱分析头孢氨苄有关物质结果最优，能够实现杂质对照溶液及高温破解所得分离度溶液的分离。在供试品溶液分析中，由于浓度较高，△-2-头孢氨苄被包于主峰中，客户反馈属正常现象，单独考察低浓度头孢氨苄与其异构体△-2-头孢氨苄的混合溶液分离情况，能够达到1.17的分离度结果。

在头孢氨苄与其异构体△-2-头孢氨苄分离中，相比C18柱，资生堂CAPCELL PAK PFP S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm（TQAD01002）色谱柱能够达到分离度为4.84的良好结果，并且，在杂质对照溶液及供试品溶液的分析中，能够得到满足药典分离要求的良好结果，供客户参考。