2022-08-20 16:25:53, 基泰生物 上海基泰生物科技有限公司
在用液相色谱进行样品分析时,有时会在流动相中加入缓冲盐,以改善峰形,提高分离度,优化保留时间,常用的盐浓度为10-20mM,但有时20mM的盐浓度还是达不到预期的效果,需要更高的浓度,我们把高于20mM的盐流动相定义为高浓度的盐流动相。使用高浓度盐作流动相时,有时会碰到一些棘手的问题,用Thermo U3000高效液相色谱仪,用乙腈:0.1M KH2PO4(35:65,v/v)作流动相,发现随着分析时间的持续,出现各种异常现象。
色谱峰异常
目标峰保留时间不断延后
压力波动异常,±1000psi
开Purge阀脱气,废液管无流动相流出
针对以上情况,进行相应的排查:
1)方法方面,增加分析时间,避免复杂基质对后续测定的干扰。
2)仪器方面,逐一排查仪器各个模块,包括色谱柱、检测器、自动进样器、泵。最后发现问题主要在泵模块。超声清洗单向阀后仪器可正常分析。然而,在单向阀清洗干净,分析时间延长的情况下,当连续分析时间过久时,如连续测试10h以上,以上问题又会发生。甚至会出现新的问题,如:多次发现比例阀不通。当疏通比例阀同时清洗单向阀后,仪器又可以使用。更严重的情况,疏通比例阀、清洗单相阀、清洗不锈钢连接管路、毛细管混合器和静态混合器后,压力依然剧烈波动,仪器无法使用。进一步排查后发现柱塞杆和密封圈已经被盐污染,密封圈甚至有轻微磨损。
为何还是无法改善?进一步思考:
1)方法方面,流动相为乙腈:0.1M KH2PO4, 0.1M KH2PO4浓度非常高,虽然乙腈和0.1M KH2PO4(35:65,v/v)可以互溶,但当0.1M KH2PO4与纯有机相相遇时非常容易发生盐析。考虑到泵和比例阀的构造:
由于实验时将0.1M KH2PO4放置于A通道,乙腈放置于C通道,使用泵的在线混合功能,混合乙腈和0.1M KH2PO4,因为0.1M KH2PO4浓度非常高,在与乙腈混合时,很容易在比例阀处发生盐析。乙腈放在下部的C通道,0.1M KH2PO4放在上部的A通道,由于重力作用,盐溶液可能会往下滴,当高浓度的盐溶液落到有机相通道时,就会发生盐析,有机相通道的出口就会逐渐被堵塞,最终只有部分甚至没有有机相进入后续的液相系统,故会发生色谱峰异常,保留时间延后,有机相(乙腈)通道purge无液体流出等问题。由于系统在比例阀处就有盐析出,而流动相还在不断冲洗,盐会继续被冲到后续部件,如单向阀、柱塞杆、密封圈、不锈钢连接管路、混合器等,导致故障发生。流路污染常常会导致系统压力波动,流路堵塞常常会导致系统压力过高。柱塞杆和密封圈受到污染和破坏后,泵会发生漏液,表现为压力波动。
对此采取了有效的方案:
(1)方法方面,预先将高浓度的0.1M KH2PO4和乙腈手动混合好,不再使用仪器的在线混合功能。
(2)仪器方面,根据比例阀上各流动相通道的位置,合理摆放流动相。纯有机相摆放在上部的A、D通道,盐溶液摆放在下面的B或C通道。问题得以解决。
说了这么多,最后总结一下用有机相和高浓度的盐作流动相时,液相方法开发小经验:
(1)等度洗脱时,最好手动将有机相和盐相混合成一相,尽量不使用仪器的在线混合功能;
(2)梯度洗脱时,注意正确设置有机相与盐相的比例,尤其是使用磷酸盐时,避免盐浓度过高时发生盐析。
(3)对于多通道低压梯度混合泵,应注意各通道流动相的摆放,有机相最好放置在比例阀上部对应的通道,盐溶液应放置在比例阀下部对应的通道。
(4)用过高浓度盐的流动相通道切换成有机相时,为避免流路里残留的盐与有机相发生盐析,需先用大比例的水置换清洗。同理,用过有机相流动相的通道切换成高浓度盐时,也要先用大比例的水置换清洗。
(5)保存在高浓度盐里面的色谱柱,如保存在150mM 磷酸盐(pH7)里面的SAX色谱柱,使用时若流动相里面含有有机相,色谱柱需先用水相置换清洗再通流动相。
(6)使用高浓度盐后的高效液相色谱仪,需及时清洗,并增加泵的维护频率。
04-28
天隆产品说丨天隆方案为动物健康保驾护航04-27
世界兽医日 | 与他们共同守护动物健康04-27
新征程,新起点|科瑞恩特(北京)科技有限公司迁址公告及五一劳动节放假安排04-26 Create
最新|2024科瑞恩特携手瑞孚迪(原PE)共赴Create生命科学新征程04-26 Create
免费下载 | 新一代测序(NGS)零基础?看这篇就够了!04-26
对话培训班用户 洞察行业需求 | 纽迈如何通过“用户洞察”驱动“产品创新”?04-26 纽迈分析
【文献解读】东华大学:武培怡/孙胜童团队《Nat. Commun.》:自愈型纳米网络弹性材料增韧人工离子皮肤04-26 纽迈分析
东华大学武培怡/刘艳军团队新发现 →树木中反直觉的水传输过程 ...04-26 化学与材料科学
卓悦榜丨艾捷博雅荣膺“年度IVD与生命科学最佳企业”奖项04-26
建设国际一流医疗器械产业链、供应链体系!深圳与通用电气医疗签署战略协议04-26
一“触”即发,pick你中意的那个它!04-26 益世科生物
实验室“老友”记——助力胚胎培养的小能手!04-26
反相色谱多肽分离系统研究第四部分 表征流动相的选择性04-26 阎作伟 编译
世界知识产权日|以创新成果引领健康未来04-26
邀请函 | 揭秘多孔介质的秘密:TESCAN在InterPore202404-26 TESCAN中国
BCA蛋白定量小包装来啦~ 还有实用干货奉上04-26 赛默飞生命科学
【反射颜色测量】典型配置、硬件说明、软件操作04-26
“生命科学进校园”科普公益项目启新程,启迪青少年创新思维04-25
沃特世推出全新GTxResolve Premier SEC色谱柱,加速基因治疗药物开发04-25 沃特世