技术前沿 | 深度解析MALDI-MSI质谱成像技术&《空间代谢组》新书预售发布

2022-08-20 06:16:21, 小迈武汉迈特维尔生物科技有限公司

前言

在典型的代谢组学实验中，均质组织被提取，然后通过LC-MS、GC-MS或NMR进行分析，尽管能获得研究样本中代谢物的定性定量数据，但丢失了化学分子空间分布信息。空间代谢组学（Spatially resolved Metabo-lomics）将代谢组学信息扩展到了三维的水平，不仅告诉我们代谢变化是“如何发生”，还能准确展示出“在哪里发生”，从而极大拓展了对代谢组学样品信息的认知。接下来小迈会详细介绍主流的空间代谢组技术MALDI-MSI。

4种质谱成像技术简介

空间代谢组学核心技术为质谱成像(Mass spectrometry imaging,MSI),质谱成像技术（MSI）是基于质谱发展起来的一种分子成像技术，按照离子源的不同，常把MSI分为以下四类:

✦基质辅助激光解吸电离质谱成像

Matrix-assisted Laser Desorp-tion Ionization Mass Spectro-metric Imaging, MALDI-MS

✦次级离子质谱成像

Secondary Ion Mass Spectro-metric Imaging, SIMS-MSI

✦解吸电喷雾离子化质谱成像

Desorption Electrospray Ioni-zation, DESI-MSI

✦激光溅射电喷雾电离质谱成像

Laser Ablation Electrospray Ionization, LAESI-MSI

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质谱成像技术原理展示（TiffanyPorta Siegelet al,2018）

四种成像技术的原理不同，技术特点也有区别。如SIMS-MSI技术无需基质、分辨率高、可3D成像，但只适用于小分子的检测；DESI-MSI无需复杂的样品前处理、无需基质、方便液体、气质样本的扩展，但分辨率相对较低；LAESI-MSI样品制备简单、高灵敏度且无需基质，但需要含水且相对稳定的样品且分辨率较低；MALDI技术需要基质辅助，分辨率高，能检测50-100000范围的分子量，是主流的质谱成像技术之一（Tiffany Porta Siegelet al,2018），接下来将详细介绍MALDI质谱成像的技术特点。

MALDI-MSI技术介绍

1. MALDI-MSI技术发展历程

MALDI（基质辅助激光解吸电离）技术于1987年首次由Hillenkamp及Karas提出，如今已有35年历史，经过科学家们的不断努力，MALDI技术也有了质的飞跃，并广泛应用于空间代谢组研究。接下来我们来了解下MALDI-MSI的历史发展进程。

MALDI技术最初是Hillenkamp及Karas提出，其早在1985年在Anal Chem发表基质辅助激光解析分析非挥发性化合物文章，并于1988年在线发表了“Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons”文章，文中对分子量超过10,000Da蛋白质进行激光解吸电离,自此拉开MALDI技术篇章。

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Hillenkamp、Karas于Anal Chem共同发表文章

MALDI技术获得广泛关注，是于2002年之后，因为田中耕一凭借激光解吸电离(LDI)技术获得诺贝尔化学奖。而德国University of Münster科学家Hillenkamp及Karas开发的基质辅助激光解吸电离（MALDI）技术离子化效率更高，逐渐成为被广泛采用的技术（周晓光：MALDI诞生30年小记）。

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田中耕一获奖照(图片来源https://www.sohu.com/a/494153503_120619005)

2. MALDI-MSI技术特点介绍

目前MALDI-MSI主要的代表仪器为德国Bruker公司推出的timsTOF flex质谱系统。timsTOF fleX质谱系统自1992年开始经6代升级（reflex / reflex MALDI-TOF / MALDI Biotyper / solariX / rapifleX系统），最终于2019年由布鲁克推出，以此开创空间定位组学新时代。

左：rapifleX仪器右：迈维代谢timsTOF fleX仪器实景图

timsTOF fleX是一款结合了高空间分辨率的MALDI源和高速、高灵敏度ESI源的平台。适用空间维度组学分析，专门设计用于解析分子分布。通过TimsTOF flex成像完的数据，使用成像分析专业软件SCiLS™Lab进行后续分析。目前基于timsTOF fleX平台研究文章已发表上百篇。

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2021年timsTOF fleX平台参与Nature文章发表

2.1

分辨率高，空间分割更准确

MALDI-MSI可实现生物样本高分辨率质谱成像，最高可达5μm，有效分辨率为5-200μm。高低分辨率对于空间代谢组检测各有利弊。高分辨率空间分割更为精准，但针对于非靶向空间代谢组物质检出通量降低，靶向空间代谢组不存在此问题。低分辨率非靶向空间代谢组物质检出相对较多，老师可针对需求选择合适的分辨率。

迈维代谢一般建议选择50μm分辨率进行实验，主要原因如下：1）分辨率相对100μm更高，更有利于对生物样本进行更准确的空间分割；2）基于timsTOF fleX质谱系统的MALDI-MSI技术50μm物质检出数量较100μm相差不大，迈维代谢50μm分辨率物质检出仍高达1000+。

针对部分研究需求，50μm分辨率不足以满足实验目的，主要两种情况：样本过小或有特别关注微观结构。针对样本过小，建议选择像素点>1000的分辨率进行实验，能有效降低实验失败的风险。若老师有特殊结构关注，需明确结构大小，保证分辨率数值远小于关注结构大小。

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100μm分辨率无法区分直径为800μm样本结构（实际失败案例）

Mohammadreza Shariatgorji等人于2019年在Nature Methods [IF——32.072]发表的文章“Comprehensive mapping of neurotransmitter networks by MALDI-MSimaging”中，为对特定大脑区域的神经递质网络进行全面映射，首先选用了50μm分辨率对大鼠大脑的矢状面进行检测，而后分别采用了20μm、10μm分辨率对含黑质大鼠脑组织进行检测，如下图所示，20μm分辨率有效展示5-HT在大脑黑质区域空间分布特征。

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5-HT在脑组织中的空间分布（Mohammadreza Shariatgorji et al,2019）

2.2

扫描范围广，物质检测数量和种类更多

MALDI-MSI技术可检测分子质量为50-100000，有效范围广，除小分子物质外，也可检测一些其他分子，如蛋白、多肽、多聚糖等，RamonC. Sun等人2021于Cell Metabolism（IF:31.373）发表了关于神经系统疾病糖基化缺陷的研究，其中利用MALDI-MSI技术对N-聚糖进行了检测。迈维代谢也成功检测了生物样本中大分子蛋白，并进行成像。

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MALDI-MSI显示小鼠脑矢状切片中糖原和N-聚糖的区域分布特征（Sun et al., 2021）

2.3

高灵敏度，提高中低含量物质检出

MALDI-MSI技术物质检测灵敏度，更有利于物质检出，减少代谢物信息遗漏。如环境污染物PFOA（CAS:335-67-1，[M-COOH]-=368.97 55），在动植物样本中用普通质谱仪器很难检出。但是在timsTOF fleX质谱仪中，灵敏度提高了30倍，在生物学样本中检测并成像了PFOA。

3. MALDI-MSI技术文章统计

对空间质谱成像技术进行文章调研，在NCBI网站Pubmed板块以空间代谢组技术离子源缩写为关键词进行搜索，其中近15年MALDI技术发表文章数量远高于其他技术总和，进一步缩小关键词为空间质谱成像（如MALDI-MSI）进行搜索，MALDI-MSI发表文章数量仍远高于其他技术总和，因此，MALDI-MSI作为主流的空间代谢组技术在学术界获得了普遍认可。

对近五年Cell、Nature、Science质谱成像文章进行汇总，基于MALDI技术在Cell、Nature、Science发表文章数量分别为17、24、14篇，获得了CNS等知名期刊的高度认可。

坚持创新，迈维代谢升级MALDI-MSI技术

迈维代谢作为国内首家引进timsTOF fleX的商业服务公司，两年以来一直致力于提供优质的空间代谢组科研服务，并在MALDI-MSI已有技术优势上进行了创新的优化升级。在MALDI-MSI原有优势上，对空间代谢组数据质量和数量上进行了重大提升，致力于更好的服务用户。

目前公司已经建立了靶向和非靶空间代谢组学检测流程，并建立了业界首个MALDI数据库，对检测过程峰标记进行优化，并实现原位自动化采集二级谱图，结合迈维代谢ESI源医学数据库，让物质鉴定更广泛和准确。另迈维代谢著有《空间代谢组应用手册》书籍，以帮助老师了解MALDI-MSI技术及进行数据挖掘。接下来让我们了解下迈维代谢创新优化升级的MALDI-MSI技术。

1. 物质定性更准确：业界首个MALDI本地库、原位采集二级谱图

空间质谱成像技术与传统代谢组离子源不同，空间质谱成像采集的物质二级谱图与传统代谢组ESI源有所差别，具体表现在离子碎片不同，或子离子响应强度不同，因此有必要建立空间代谢组专属数据库，以提高代谢物鉴定准确性。

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MALDI源与ESI源二级谱图对比

迈维代谢为提供更准、更多的代谢组数据，针对标准品建立业界首个空间质谱成像数据库（MALDI本地库），主要针对标准品喷涂不同基质，使用空间质谱成像仪器timsTOF flex采集二级谱图，最终数据库共1750+物质，总共包含25大类92小类，物质种类全，分类详细，更有利于老师数据挖掘。数据库物质种类及分布情况见下图。

除MALDI本地库外，迈维代谢还拥有业界领先的医学、植物本地高分辨数据库，有效提高物质鉴定通量。其中医学总库物质数量达29万，植物本地数据库高达20000物质。

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医学数据库一览图

目前不少空间质谱成像技术采用物质一级谱图进行定性，并未采用二级谱图，对于代谢物定性准确性来说存在一定不足。迈维代谢经两年潜心研发，实现了原位采集物质二级谱图，并结合业界首个空间质谱成像数据库（MALDI本地库）对物质进行定性，有效提高物质定性准确度，确保用户数据准确性。

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迈维代谢实际项目二级谱图镜像对比图

2. 物质鉴定数量更多：扫描范围大、数据库大

迈维代谢MALDI-TOF MS检测中质量参数设置为50-1300Da，可更好的全面检测小分子代谢物。物质定性方面，除MALDI本地库外（1750个物质），迈维代谢还结合医学总库（29万个物质）、植物高分辨数据库（20000物质）进行定性，让物质鉴定更广泛和准确。另外迈维代谢原位采集样本中的二级谱图，有效提高物质鉴定准确性。目前迈维代谢MALDI-TOF MS平均可检测到1000多个高质量物质（经提取、平滑去噪、归一化处理），其中二级准确定性物质400个左右。实际项目数据示例：脑组织冠状面进行50μm分辨率检测，总物质数1478，二级定性物质数高达386，覆盖19大类，物质类别展示见下图。

3. 数据分析和服务更专业

迈维代谢使用SCiLS™Lab专业成像软件进行离子图像和谱图的可视化，通过无限制样本数据的先进机器学习算法，实现空间分割的自动注释。同时支持手动划分区域，完成感兴趣区域代谢特性的个性化分析。如利用Segmentation、t-SNE、UMAP分析了解代谢空间分割详情，利用代谢物共定位分析挖掘代谢物之间的关系，利用代谢物与空间位置共定位分析筛选区域标志物。