Unbelievable！MST 检测互作亲和力还可以免纯化？（医学篇）

2022-08-11 14:34:28, NanoTemper 诺坦普科技（北京）有限公司

前言

进行蛋白质互作分析时你是否也遇到这样的问题：

1. 基于生物物理方法进行互作亲和力检测一般需要高质量和纯度的蛋白。因此，必须建立合适的纯化体系，然而一些蛋白本身很难纯化，如膜蛋白。

2. 亲和力检测通常在人工缓冲系统中进行，与存在天然配体、底物和离子的体内情况相比，这可能极大地影响结合研究的结果。

使用MST技术进行互作亲和力检测可以解决以上问题！既然难纯化，使用MST技术可以免纯化！！！想要模拟体内环境，那就在裂解液环境下甚至用全细胞进行亲和力检测！

下边跟着小编来看两个MST免纯化互作检测的案例吧！

MST应用案例一

在裂解液中检测膜蛋白与小分子互作

抗抑郁药物（AD）结合到靶点上进而产生临床抗抑郁效果的机制尚不清晰。赫尔辛基大学研究人员发现脑胆固醇（CHOL）可直接与神经营养酪氨酸激酶受体2 (TRKB) 跨膜域(TMD)结合，进而调节TRKB信号通路。此外，发现典型和快速作用的抗抑郁药直接结合到TRKB TMD二聚体形成的一个位点上，从而促进TRKB细胞表面表达，增强脑源性神经营养因子（BDNF）信号传导。该研究解决了关于抗抑郁药临床疗效的基础分子机制问题。

在此研究中，作者使用MST技术检测TRKB与CHOL和ADs的结合。TRKB为跨膜蛋白，且分子量较大92kD，很难纯化。作者将GFP-TRKB质粒转染至HEK293T中过表达。进行互作亲和力检测时，直接将过表达GFP-TRKB的HEK293T细胞裂解后取上清。以GFP-TRKB融合蛋白作为荧光信号源，进行MST检测。

向HEK293T细胞裂解液中加入梯度稀释的CHOL，通过MST技术检测到CHOL与GFP-TRKB的亲和力为~20μM。表明CHOL可直接与TRKB结合，突变TRKB 433位关键氨基酸破坏了TRKB与CHOL之间的相互作用。

图1：TRKB与CHOL直接相互作用

抗抑郁药结合TRKB跨膜结构域

MST结果显示了抗抑郁药氟西汀（FLX）和GFP标记的TRKB在HEK293T细胞裂解液中的直接相互作用。

图2 FLX结合TRKB跨膜结构域

MST应用案例二

完整细胞与蛋白间的亲和力检测

如果研究对象是完整的细胞、细菌或者病毒，MST技术仍然可以应对。^[1][2]

血小板膜含有多种蛋白质，这些蛋白质往往连接大量的糖链而成为糖蛋白。(GP) Ib-IX-V复合物是血小板主要糖蛋白之一，维持血小板结构的完整性，具有凝血酶受体功能。(GP) Ib-IX-V是异质多聚体，其中GP Ib由CD42b、CD42c以二硫键相连而成。CD42b为跨膜蛋白，其含糖量占总分子量的60%。使用MST实现了完整血小板表面上的CD42b与其抗体之间的亲和力检测^[1]。