抗体药物研究中电荷异质性分析

2022-08-10 16:51:10 艾杰尔-飞诺美(Agela & Phenomenex)




由于蛋白翻译后修饰和降解而产生的电荷异质性属于治疗性抗体的关键质量属性(critical quality attributes, CQA),因此对于抗体药物电荷异质性的分析贯穿于抗体药物的全生命周期,其中包含细胞株筛选、制剂配方开发、上游工艺优化、下游纯化工艺开发、工艺放大、稳定性研究、批间次比对、分析方法开发验证、产品质量标准建立以及质量鉴定和放行等。由于造成抗体药物电荷异质性的原因错综复杂,所以现在必须结合离子交换色谱HPLC, CE-MS等多种表征方法。




对于选择离子交换的HPLC分离模式来说,最关键的是保证分析物和固定相带不同的电荷,通过中和其中之一或者用更强的相互作用取代两种方式可以打破这种离子相互作用。也就是通过盐梯度,或者pH梯度来达到洗脱分析物的目的。


因为溶液的pH值会影响蛋白质的净电荷,我们可以利用蛋白质的多重电荷来调节对固定相的吸附。pH值的变化或通过与缓冲盐溶液竞争性结合的洗脱都可用于洗脱蛋白质。pH值离等电点越远,分析物的电荷越多。如果pH值低于pI,那么蛋白质将带有净正电荷——因此我们将使用阳离子交换分离。对于蛋白质而言,这种情况更常见,即pH梯度将从低pH开始,而盐梯度将从pI以下开始。相反,不太常用的方法是使流动相的pH值高于pI;比如RhuEPO蛋白有更多的去质子化酸性物质,因此蛋白质携带净负电荷。在这种情况下,我们将使用阴离子交换柱。


阳离子交换

VS

阴离子交换


因此这里重点介绍bioZen 6 µm WCX色谱柱, Phenomenex的新型离子交换柱,用于单克隆抗体和重组蛋白的电荷异质性关键质量属性测定。


该颗粒是具有羧酸官能团的无孔聚苯乙烯二乙烯基苯。这是单一大小或单分散的颗粒,因此总体上具有更高的效率和更好的重现性。PS-DVB颗粒上的其他独特颗粒-亲水层已进一步交联,以增强颗粒的惰性。这对于防止发生非特异性疏水相互作用,确保完全的蛋白质回收非常必要。此外,已接枝到颗粒上的线性聚合物为1M Da。这对较大的蛋白质具有更好的选择性。



通常在阳离子交换色谱中有两种洗脱模式的方法,盐梯度(其中洗脱基于钠离子置换)和 pH 梯度(其中洗脱基于分析物 pI 的变化)。此示例显示了 pH 和盐梯度之间的差异,以酸性和碱性变体的面积百分比表示。


两者都使用常见的梯度: 通过使用更接近曲妥珠单抗 pI 的流动相 pH(即缓冲液)并适当优化该梯度,可以很好地优化盐梯度。但无论哪种方式,梯度方法的实现有利有弊;当然,这个例子的 pH 梯度可能看起来“更好”,但实际上,盐梯度检测也非常普遍;通过此分析图谱可以看到酸性/碱性变体在 pH 梯度或盐梯度中的表现会不同。

梯度

变体

%

盐梯度

酸性

31.2

碱性

9.6

pH梯度

酸性

31.3

碱性

14.0


实际在方法开发中,我们还可以尝试双相 MES/HEPES pH & 盐梯度

在这里,我们分别在流动相 A 和 B 中采用 MES 和 HEPES 中的两种缓冲盐。它们具有不同的 pKa。在流动相 a 和 b 中使用它们可模仿 pH 梯度。在流动相 B 中,我们添加了较低浓度的 NaCl,从而增加了一点盐梯度。


现在的梯度既有pH 梯度又有盐梯度。它可达到类似于使用 pH 梯度观察到的分离。可分离英夫利昔单抗中的酸性 mAb,一直到 pI 高于 9 的碱性 NIST mAb。同样,分离可以平台化,从而便于方法开发和方法转移。


BioTi 硬件可运行高流速


总  结

开发一个WCX的色谱方法,我们还是要遵从常见的HPLC方法来做方法学验证,biozen WCX在不少抗体药物成功的色谱方法应用中提供了不错的分离度,重现性,批次稳定性等。

  • 盐梯度/pH梯度

  • 流动相的pH及离子强度

  • 分离度与稳定性

分析方法开发及验证考虑的参数

  • 专属性

  • 准确度

  • 精密度

  • 耐用性


最后,WCX-HPLC的分析小技巧总结如下:

  • 阳离子交换色谱法是测定蛋白质酸性和碱性变体的常用方法

  • 对于盐梯度,MES缓冲液优于磷酸盐缓冲液

  • 盐梯度要求对每个单克隆抗体进行梯度优化,结果有时与pI没有直接关系

  • 在盐梯度中,梯度对分离的影响最大

  • pH梯度可以有效地用于测定蛋白质的表观pI

  • 柱长和流速不影响分离

  • 准确配置pH缓冲液或者用市售标准pH缓冲液可提高结果重现性



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