生物素(BioID)标记蛋白——in vivo and in vitro的应用!!!

2022-07-30 11:17:50, 搬砖小陈 上海吉凯基因医学科技股份有限公司


在后基因组测序时代,重点已经转移到鉴定和表征细胞的蛋白质补体,即蛋白质组,这项工作的关键是使用简单而有效的纯化蛋白质和蛋白质复合物。基于亲和力的纯化方法中最突出的是生物素/抗生物素蛋白系统(BioID)。

BioID的特点

生物素是一种天然存在的代谢酶辅助因子,仅当通过特定蛋白质-生物素连接酶的作用与酶共价连接时才具有活性,任何生物素化的底物都可以与蛋白质亲和素和链霉亲和素紧密结合,主要优势是:


1. 高灵敏度——生物素和链霉亲和素之间的亲和力(Kd=10-15mol/L)比抗体介导的相互作用高 >1,000 倍,从而可以更有效、更稳定地捕获蛋白质复合物。


2. 高特异性——这种方法避免使用抗体,从而显著减少非特异性结合。此外,生物素-链霉亲和素的非凡稳定性允许严格纯化以消除蛋白质污染。


3. 高适应性——链霉亲和素与生物素的结合是快速、特异性的,并且在大多数其他蛋白质已经变性的条件下仍然可以发生,例如高温或 6 M 盐酸胍或 1% 十二烷基硫酸钠 (SDS),生物素化蛋白可以通过一步程序直接从粗提物中有效纯化,而最常用的亲和标签在亲和结合步骤之前需要许多纯化步骤。


4. 经济且可靠——若要下拉蛋白,通行的做法是购买抗体,但抗体是昂贵的,且抗体的质量会因供应商及批次而异,费钱、耗时,延伸导读《抗体验证》。

BioID技术路线

因此,通过生物素标记纯化的蛋白质是实现蛋白质捕获、固定化和功能化以及多聚化或桥接分子的有效方法。化学生物素化通常会产生异质产物,其功能可能受损。本文介绍的是利用生物素连接酶 (BirA)将生物素共价连接到 15 个氨基酸的AviTag 肽,实现对跟AviTag融合蛋白复合物的下拉,该法不同于lncRNA在体外的生物素标记,可以实现在细胞里面。


BirA 的天然底物是生物素羧基载体蛋白 (BCCP),需要与目标蛋白融合至少 75 个残基,较长残基与基因的融合可能会造成蛋白构象、功能的改变。噬菌体展示选择促成了AviTag(也称为受体肽,AP)的开发,它作为 BirA底物优于BCCP,但长度仅为 15 个氨基酸,因此扩展了适合于位点特异性酶促生物素化的蛋白质位点范围。


BioID应用

Liu1等人,将AVI与dCas9融合,再辅以BirA的表达,针对感兴趣的基因组位置设计sgRNA,通过高亲和力链霉亲和素纯化分离基因组位点相关的大分子。通过基于质谱 (MS) 的蛋白质组学和高通量测序对纯化的蛋白质、RNA 和 DNA复合物进行鉴定和分析,分别用于研究天然顺式调节蛋白、RNA和远程DNA相互作用。



作者采用了经过验证的端粒靶向sgRNA(sgTelomere;图1C),它显示了dCas9-EGFP融合蛋白对端粒的特异性标记,与非靶向 dCas9-EGFP的弥漫性核仁定位形成对比(图1D)。在sgTelomere和生物素化dCas9 稳定共表达后,观察到端粒DNA显著富集(图1E)。已知的端粒相关蛋白TERF2在表达sgTelomere的样本中高度富集,但在的对照样本中没有(图1F)。最重要的是,通过基于iTRAQ的蛋白质组学,鉴定了许多已知的端粒维持蛋白和新的端粒相关蛋白。


BirA的新应用已用于标记特定的蛋白质群—通过将 BirA 靶向特定的染色质相关蛋白,特定的 AviTag 连接的核小体群被生物素化2;通过将 BirA 靶向一个突触膜,对面突触膜上的 AviTag 蛋白被生物素化,从而可以对突触处特定的蛋白质-蛋白质相互作用进行成像3;通过在拟南芥、秀丽隐杆线虫或黑腹果蝇的特定组织中表达核膜蛋白上的 BirA 底物肽和 BirA,可以通过链霉亲和素下拉分离来自特定细胞类型的细胞核4;此外,使用酶来实现混杂的生物素化(BirA 突变体或过氧化物酶)已经能够标记特定细胞区域或隔室中的未标记蛋白质5

结 语

生物素连接酶BioID也不总是有优点,比如使用BioID的实验需要超过 16 小时才能完成,并且需要向细胞中添加高水平的生物素;新型的生物素连接酶TurboID比BioID更活跃,能够在十分钟内标记蛋白质,然而,在某些条件下,它也更有可能对细胞产生毒性以及非特异性。日本科学家报道了新型分子AirID6,疑似毒性小于TurboID。无论如何,生物素技术的不断改进一定会给分子领域带来全新的发展,吉凯基因在分子互作领域深耕,提供上下游分子构建,蛋白质组、iTRAQ、质谱等一系列的服务,快来咨询吧!!!


Tips:体外BioID实验流程见<< Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA >>;体内BioID实验流程见<< In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9 >>.


【参考文献】

1.In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9;

2.Elucidating combinatorial histone modifications and crosstalks by coupling histone-modifying enzyme with biotin ligase activity;

3. Imaging Trans-Cellular Neurexin-Neuroligin Interactions by Enzymatic Probe Ligation;

4. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling;

5. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells

6. AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein–protein interactions


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