取样干货 | 如何准备合格的转录组+代谢组样本（动物医学篇）

样本的准备是开始转录组+代谢组项目的第一步，也是决定一个项目能否成功的最关键环节。样本取样及时，合理，后续实验数据有代表性，挖掘数据时更有针对性。转录组+代谢组项目，设计到两个组学，所以取样时需要更加严格。植物相关的研究中，常见的样本类型包括动物组织样本，血液样本，细胞样本，微生物样本。

下面我们从取样准备，转录组+代谢组取样原则，不同样本类型取样流程，送样量要求及样本包装和寄送来进行详细阐述，帮助老师顺利开展实验。

●无水乙醇（分析纯和优级纯均可）500ml；

●双蒸水（去离子水），预冷的PBS等清洗试剂；

●解剖剪、镊子、刀片（可用酒精棉擦净后锡纸包好，180度烘箱4小时进行处理）；

●液氮3L；

●干冰10-15kg（也可取样液氮冷冻后放置在-80℃冰箱，样本寄送时再订购干冰）；

●商品化无RNase的离心管（1.5ml/2ml/5ml/10ml/15ml/50ml），如Eppendorf、Extragene等；

●一次性口罩，一次性手套，橡胶手套，锡箔纸，超纯水，酒精棉，无纺布。

注：如需野外采样，需准备冰袋、冰盒。

●实验前用酒精棉擦拭工作台面，建议在超净工作台中操作（RNA易降解）；

●锡箔纸铺台面，用酒精棉擦拭锡箔纸，后续操作在锡箔纸铺的台面上进行；

●将所有用到的锡箔纸表面、镊子、解剖剪、刀片用无水乙醇擦一遍；

实验全程佩戴一次性口罩；

●实验全程佩戴橡胶手套；

●预实验称重。

由于在液氮速冻之后，锡箔纸、自封袋、封口膜等类型的包装容易在运输过程中发生破裂，导致样品混杂，因此在样品保存的时候要求用离心管进行包装；同时要求包装的内容物不能超过离心管体积的70%，过大的样品量容易造成离心管破裂。

转录组+代谢组取样要遵循5大原则，即代表性，一致性，准确性，迅速性，低温保存原则。

1.代表性

正确识别所要研究的组织部位，剔除与研究无关的组织部位。

2.一致性

单一变量原则。在条件允许的前提下，争取做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面可能保持一致。

3.准确性

代表性样本的各种特征数据必须被准确记录。样本充分混合后分为两份，分别进行转录组，代谢组检测。

4.迅速性

采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。

5.低温保存

样本离体后，分离步骤在4℃或冰上进行，分离后的样本立即置于液氮中速冻，-80℃保存，干冰运输。

1）优先选择新鲜采集样品送样；

2）活体取材后立即用Rnasefree水进行漂洗，去除血渍和污物，剔除结缔组织和脂肪组织等非研究部位；

3）若组织体积较大，将组织切成长宽高均≤0.5cm的小块（即黄豆大小），组织样品处理及切割过程应在冰上尽可能快速进行，时间过长会导致样品RNA降解；

4）将处理好的组织样本混合均匀后，液氮速冻后放入预冷螺纹的EP管中，-80℃保存，干冰寄送。整个取样过程保证在断血后半个小时内处理完成；

5）为确保实验的顺利，建议样品备份1-2份，以防备部分样品降解重新取材、制备或送样，耽误时间。

全血mRNA中含有高丰度的globinmRNA转录本。这些转录本可以占到全部mRNA组分中的70%。这些转录本序列保守，研究价值极为有限，因此其存在会造成数据浪费，并显著降低对其他低丰度转录本检出的灵敏性。由于globinmRNA主要来自成熟红细胞，因此迈维强烈建议全血提取时先分离白细胞后再提取RNA。若实在无条件分离白细胞，可以用全血收集管送样，但务必与驻地销售先行沟通。

1）在已加入抗凝剂（推荐EDTA，禁止使用肝素）的新鲜全血中加入等体积PBS（1×），充分混匀；

2）缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的离心管中，并使上述混合液处于淋巴

细胞分离液液面之上（即两种液体不要混合，保留清晰的接口），3000g离心

30min；

3）用移液器小心分离出白细胞层，用PBS（1×）清洗白细胞，离心回收白细胞，

弃去上清；

4）按2mL血液分离的白细胞加入1mLTRizol的比例加入适量TRIzol试剂，用吸头将细胞团吹打散，或者激烈震荡混匀，使细胞完全溶于TRIzol中充分裂解；

5）转移至-80℃低温保存，送样时选择干冰运输寄送。

如果不具备分离白细胞条件，建议将新鲜血液加入三倍体积TRIzol，混合均匀后-80℃冻存，干冰送样。全血样品RNA易降解，不建议直接速冻送样，建议TRIzol保存送样（该方法需跟销售代表沟通后送样）。

（1）血浆

用含有EDTA或肝素钠的采血管采集血液后（微生物组不能使用肝素钠抗凝），立即轻轻颠倒混匀，在4℃条件下3000rpm离心10min，吸取上清液（即血浆）200μL置于合适的已编号的2mL离心管中。

（2）血清

用含有促凝剂的血清分离胶采血管（常用品牌推荐：BD）采集血样，室温静置（注意:不能振摇采血管）60min 使其凝结后，4℃条件下3000rpm 离心10min，吸取上清液（即血清）200μL 分装于合适的已编号的2mL离心管中。

样品保存：液氮速冻 5-10min，-80℃冰箱保存，避免反复冻融。

样品寄送：预约干冰进行样品寄送，由于温度不同，干冰挥发程度不同，建议按照5kg/天计算，一般时效性在3天，约需要15-20kg干冰，准备足量的干冰，避免冻融。

样本备份：

为避免多个实验造成样本反复冻融，防备部分样品降解重新取材、制备或送样，建议样品按需多管分装存储，至少备份 1-2份。

●倒掉培养基，加入1.5mL无菌1×PBS溶液，用移液枪吹打细胞，直到细胞全部脱离瓶底为止；

●对于贴壁牢固的培养细胞，可以用细胞刮勺剥离细胞。将细胞连同PBS溶液一起收集到无核酸酶的2.0mLEP管中，300-500×g（1100-1500rpm）离心5分钟，弃上清，收集沉淀细胞；

●离心收集的细胞立即速溶于TRIzol裂解，参考用量为每1×106个细胞加1mLTRIzol，细胞溶于TRIzol后，如出现成团，需用吸头将细胞团吹打散，或者激烈震荡混匀，使细胞完全溶于TRIzol中充分裂解，充分裂解后的样本分成两管，一管用来做转录组，一管用来做代谢，之后转移至-80℃低温保存，送样时选择干冰运输寄送；

●或者离心收集的细胞直接液氮速冻后，转移至-80℃低温保存，送样时选择干冰运输寄送。

●倒掉培养液，用无菌1×PBS溶液洗涤细胞，然后加入正好能盖住单层细胞的胰酶溶液：如150mm培养瓶需加入2mL胰酶溶液，100mm培养皿需加入1mL胰酶溶液。轻轻晃动器皿使胰酶均匀分布在细胞层上，直到细胞松动（一般1-2分钟）；

●一旦细胞松动，尽快弃去胰酶溶液（倾斜平皿或培养瓶以便用枪头尽量吸去多余的溶液），加入1×PBS溶液，用移液枪吹下贴壁的细胞；

●将细胞连同PBS溶液一起收集到Nuclease-free的螺纹旋盖的EP管中，300-500×g（1100-1500rpm）离心5分钟，弃上清，收集沉淀细胞；

●离心收集的细胞立速溶于TRIzol裂解，参考用量为每1×106个细胞加1mLTRIzol；细胞溶于TRIzol后，如出现成团，需用吸头将细胞团吹打散，或者激烈震荡混匀，使细胞完全溶于TRIzol中充分裂解；充分裂解后的样本分成两管，一管用来做转录组，一管用来做代谢，之后转移至-80℃低温保存，送样时选择干冰运输寄送；

●或者离心收集的细胞直接液氮速冻后，转移至-80℃低温保存，送样时选择干冰运输寄送。

●将悬浮的细胞连同培养液一起倒入合适的离心管中，300-500×g（1100-1500rpm）离心5分钟；

●使用无菌1×PBS溶液洗涤沉淀的细胞，转入1.5或2.0mL离心管中，300-500×g（1100-1500rpm）离心5分钟，弃上清，收集沉淀的细胞；

●离心收集的细胞立速溶于TRIzol裂解，参考用量为每1×106个细胞加1mLTRIzol；细胞溶于TRIzol后，如出现成团，需用吸头将细胞团吹打散，或者激烈震荡混匀，使细胞完全溶于TRIzol中充分裂解，充分裂解后的样本分成两管，一管用来做转录组，一管用来做代谢，之后转移至-80℃低温保存，送样时选择干冰运输寄送；

●或者离心收集的细胞直接液氮速冻后，转移至-80℃低温保存，送样时选择干冰运输寄送。

1.5菌体组织样品采样建议

1）除去培养基，收集菌体后，进行混合，后分为两管，一份用来做转录一份用来做代谢，避免后期冻融后分管导致RNA样品降解，分样后立即液氮速冻，-80℃保存，干冰寄送；

2）不建议用RNAlater保存，因为RNAlater密度较大，提取时不易分离菌体；

3）不建议用TRIzol裂解液送样，因为有的菌体用TRIzol法提取不成功。

取样示例：

1. 用1.5ml或2ml离心管保存和寄送，建议将样品管盖用封口膜缠绕4-5圈;

2. 所有组织样品均建议离体后立即液氮冻存，然后-80℃保存;

3. 寄送过程中要求干冰保存，为了防止样品运输途中由于干冰挤压而损坏，建议将EP管放置在冻存盒中。

4. 长年保存的组织：组织样本保存时间超过一年或以上，RNA提取风险加大，RNA质量较差，不建议送样。此类组织包括植物老根、果实等鉴于这类组织RNAase非常活跃的特点，组织部位离体后，务必在半分钟内将离体组织用液氮速冻，放入-80℃冰箱中保存。如果组织离体超过1分钟未进行处理，活跃的RNase很可能以惊人的速度在降解RNA，RNA的质量难以保证。

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