干货分享 | 浅谈基因组Survey

随着测序技术的飞速发展，越来越多的物种基因组被揭秘。目前，基因组denovo研究可谓热火朝天。了解一个物种就要从拿到它的基因组序列开始做起，拥有了一个物种的基因组，才能更好的制定后续研究方案。因此基因组测序现在已经成为生物学研究的一个重要手段。

然而，基因组的杂合度和重复序列对后续基因组组装有很大的影响，高杂合的基因组往往无法合并姊妹染色体，导致组装的结果偏大，而重复序列在组装中会被折叠，使组装中出现缺口、错误，导致组装的结果偏小。不同的生物体的基因组之间杂合率和重复序列含量差异巨大，因此在进行基因组测序前往往需要对基因组的特征进行调研，基因组survey便应运而生。

提到基因组Survey分析就不得不提K-mer分布频率分析，这是目前最常用的基因组Survey方法。所谓K-mer分布频率分析，是先对物种进行二代测序，在测序数据的基础上，通过K-mer的相关分析，获取该物种基因组的大小、杂合度、重复序列比例等特征。

所谓K-mer，是指从一段连续的测序序列中迭代地选取长度为K个碱基的序列。即当一条reads的长度为L时，经过迭代选取会产生L-K+1个K-mer。如图1所示，第一行为测序获得的reads序列，长度L=9，当设定K=4时，可获得从第二行至第七行的6个K-mer序列。因此，当基因组测序产生的reads总数为n时，则基因组的K-mer总数Nk-mer=（L-K+1）* n。

图1 | K-mer示例图

我们一般选用17-mer来估算基因组大小，因为ATCG四种不同的碱基组成长度为17的核苷酸有4^17(17,179,869,184)，足以覆盖一般物种的基因组大小。如果K-mer设置过大，则导致内存占用过多，设置过小，则不能保证K-mer在基因组中的独特性。基因组估计值可以用下面公式得到：

图2 | 基因组大小计算公式

Survey数据分析包括对二代测序原始数据进行质控、检测数据是否存在污染、K-mer分析、基因组特征评估等。完成数据分析后会得到survey数据分析图。下面简单介绍一下survey分析图是如何解读的。

1. 简单基因组的survey分析图：

在理想状态下，k-mer曲线服从泊松分布，即只会出现一个明显的主峰，若只有一个主峰，为纯合体或单倍体。因此，当基因组中不存在杂合区和重复序列，或者杂合度较低、重复序列在整个基因组中占比较少时，通常会看到如下图所示的K-mer频率分布图。

图3 | 简单纯合基因组的survey分析图

2.重复序列较多的基因组的survey分析图

基因组复制事件会使基因组中产生大量的重复序列，重复序列的存在使得基因组中某一个K-mer序列增多，即K-mer的出现频率增加。若存在一个主峰和一个次峰，且次峰的位置是主峰位置的2倍，说明一部分片段出现的期望值是大部分的两倍，这些片段为重复片段，次峰为重复峰，如图四所示。

图4 | 重复序列较多的基因组的survey分析图

3. 杂合度较高的基因组的survey分析图

在高杂合基因组中，序列中的杂合位点会使得K-mer分成两个部分，序列中某些碱基的覆盖深度也会相应减半。因此，与纯合序列相比，杂合片段中K-mer的覆盖深度会下降50%，说明部分片段出现的期望值是大部分的1/2，当序列有杂合时，包含杂合位点的K-mer 因为分成了两部分，所以出现频率变为一半，次峰为杂合峰。最终在K-mer曲线上表现为：在主峰前对应横坐标的1/2处出现一个小峰，且基因组的杂合度越高，该峰越明显。

图5 | 杂合度较高的基因组的survey分析图

在利用二代数据进行基因组Survey时，借助K-mer分析能够初步获得基因组大小、重复序列比例、杂合度等信息。当然，在实际应用过程中，由于物种本身的特性，所得到的图形并不总是尽善尽美，还需要根据具体情况做进一步分析。

以上就是本文的主要内容啦，谢谢观看。

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生信部  撰文

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