项目文章 欧易单细胞转录组+V(D)J测序助力解析Kdm6b调节肠道上皮内TCRαβ+CD8αα+淋巴细胞成熟和细胞毒性的机制

欧易生物首篇单细胞转录组+V(D)J测序文章来啦！近日，欧易生物合作客户广州医科大学附属肿瘤医院张笑人团队和中国科学院分子细胞科学卓越创新中心吴宝金团队合作在Cell Death and Differentiation（IF:15.828）发表Kdm6b调节肠道上皮内TCRαβ⁺CD8αα⁺淋巴细胞成熟和细胞毒性的相关结果，张浩浩博士、胡一鸣博士和刘丹丹博士为文章共同第一作者，欧易生物提供了该项目的单细胞转录组+V(D)J测序和Cut&Tag测序，下面我们一起学习这篇文章的具体内容。

材料：小鼠小肠分选肠上皮层淋巴细胞（IELs）

期刊： Cell Death and Differentiation

发表时间：2022年1月9日

方法：欧易生物10× Genomics转录组和V(D)J测序，Cut&Tag

肠上皮内淋巴细胞（IELs）沿肠道分布，被认为是免疫监测的前线，肠上皮内淋巴细胞（IELs）主要由经典的CD4⁺、CD8αβ⁺ T细胞和非经典的CD8αα⁺ T细胞组成。已有报道表明转录因子包括T-bet、Runx3、Stat3、Smad3、cMyc和HIF-1对IELs的发育、分化与功能十分重要，但对IELs表观遗传水平的调控仍然了解甚少。

组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27Me3）是一种重要的组蛋白修饰，其参与基因表达调控，Kdm6b是一种参与H3K27Me3的去甲基化的表观遗传酶，前期研究表明其能够促进H3K27Me3在Rorc、S1pr1和Pdlim4基因位点上的去甲基化进而维持Th17细胞分化和胸腺细胞迁移，Kdm6b的缺失可以调控自然杀伤T细胞的谱系特异性表观遗传程序，Kdm6b在粘膜相关自然T细胞的效应反应中表达上调。另外，IELs发育重要因子维生素D可以诱导Kdm6b的表达，但是Kdm6b是否以及如何调节IELs的发育和功能仍然存在许多未知。因此本篇文章作者旨在解析Kdm6b对不同IELs亚群特别是TCRαβ⁺CD8αα⁺的发育、分化与功能的调控机制。

本篇文章作者主要证明了Kdm6b能够以细胞内作用方式调控小肠IELs的发育和功能。作者首先构建了T细胞中条件性敲除Kdm6b的小鼠模型（Kdm6b^F/F-CD4Cre），通过单细胞转录组和V(D)J测序发现Kdm6b的缺失导致IELs中TCRαβ⁺细胞的比例减少，TCR多样性降低以及TCR V-J基因重排的差异，发现Kdm6b在维持在小肠IELs稳态中的关键作用。随后通过流式证实Kdm6b的缺失会破坏IELs胸腺前体细胞IELPs的稳态和迁移，促进TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs凋亡，从而导致肠道中TCRαβ⁺CD8αα⁺数量减少。通过bulk RNA-Seq、ChIP-qPCR和CUT&Tag-seq等表明Kdm6b能够通过清除相关基因增强子和启动子区域的抑制性H3K27Me3修饰来促进TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs抗凋亡基因Bcl2及细胞毒性基因Gzmb和Fasl的表达，从而促进TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs的成熟，Kdm6b也能够通过降低启动子上的H3K27Me3水平调控肠道归巢分子CCR9的表达。总之，以上结果表明Kdm6b对TCRαβ⁺CD8αα⁺肠上皮内淋巴细胞成熟和细胞毒性的重要作用。

1. 单细胞转录组和V(D)J测序表明Kdm6b控制小肠IELs的异质性和TCR多样性

首先作者对Kdm6家族的Kdm6a和Kdm6b在不同T细胞亚群的表达情况进行分析，发现 Kdm6b在不同的IEL亚群中表达均高于Kdm6a（Fig. 1a）。随后作者构建了T细胞特异的条件性敲除Kdm6b小鼠模型（正常组Kdm6b^F/F 和敲除组Kdm6b^F/F-CD4Cre）。利用单细胞转录组和V(D)J测序技术对CD45⁺小肠IELs进行分析，共捕获5880个Kdm6b^F/F小鼠细胞，6488个Kdm6b^F/F-CD4Cre小鼠细胞。降维聚类后共分为8个cluster，cluster 1、3、5、6、7在两组的占比有很大差异，说明Kdm6b在T细胞中的缺失改变了小肠IELs的异质性（Fig. 1b）。除了cluster 8被鉴定为DC，其余都为T细胞（Fig. 1c）。cluster 6细胞比例减少最为明显，其Top marker基因为Trav3-3（Fig. 1d和e）。通过分析TCR表达，发现在Kdm6b缺陷小鼠TCRαβ⁺细胞的比例（包括cluster 3，5，6）减少，TCRγδ⁺细胞（包括cluster1和7）比例增加（Fig. 1f），TCR多样性降低（Fig. 1g）。同时，Kdm6b的缺失也会导致TCR V-J基因重排的差异，在Kdm6b正常的IELs中，Trbv13-3-Trbj1-1为最主要的V-J基因组合，而在Kdm6b缺失IELs中最主要的V-J基因组合变为Trbv5-Trbj1-4（Fig. 1h）。这些结果表明Kdm6b在维持小肠IELs稳态中的关键作用。

Fig. 1单细胞转录组和V(D)J测序表明Kdm6b控制小肠IELs的异质性和TCR多样性

2. Kdm6b对TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs具体调控机制分析

后续作者从多个方面证明Kdm6b对TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs具体的调控机制。

（1） 通过流式细胞术分析了不同IEL亚群，发现Kdm6b^F/F-CD4Cre组中主要是非经典的TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs表现出更明显的比例降低，以及作为TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs胸腺前体的TCRαβ⁺DN (TCRαβ⁺CD8α^-CD8β^-) IELs在小肠中的数量显著降低，而其胸腺中IELs的前体IELPs比例则显著升高，小肠和脾脏中则显著减少，这些结果表明Kdm6b^F/F-CD4Cre中IELs异质性改变主要是由于TCRαβ⁺ IELs的减少引起的。因此，Kdm6b对非经典的TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs具有重要的调控作用，并且Kdm6b对于维持胸腺IELPs的稳态也具有重要作用；

（2） 构建条件型Kdm6b敲除（Kdm6b-cKO）和野生型骨髓细胞移植模型，发现Kdm6b-cKO组中TCRαβ⁺ IELs和TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs显著减少，IELPs显著升高，与Kdm6b^F/F-CD4Cre的结果一致，表明Kdm6b能够以细胞内作用方式直接影响TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs的生长发育；

（3） 为了分析Kdm6b能否调控TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs的肠道归巢过程，对IELs肠道归巢的关键分子α4β7、CCR9和CD103表达进行分析，发现Kdm6b缺失组中，α4β7⁺ IELPs没有显著变化，CD103⁺ IELPs比例以及CD103⁺ IELPs中CD103的表达强度显著减少，TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs则低表达CCR9（Fig. 4）。ChIP-qPCR结果表明TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs中CCR9启动子区域H3K27Me3修饰水平在Kdm6b敲除细胞中显著增加。这些结果表明Kdm6b能够调控IELPs迁移到小肠过程；

（4） 基因表达调控方面，作者对Kdm6b缺失组和正常组肠TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs进行RNA测序，差异基因富集分析发现主要差异通路为细胞凋亡，DNA复制和NK细胞介导的细胞毒性上（Fig. 2）。RT-qPCR验证了一些差异表达基因包括CCR9、抗凋亡基因Bcl-2和TCRαβ⁺CD8αα⁺ IEL特征基因的表达。H3K27Me3 CUT&Tag-seq热图显示H3K27Me3在基因组水平上的转录起始位点显著富集，ChIP-qPCR进一步显示Kdm6bF/F- CD4cre小鼠IEL中Ccr9、Klrd1和Klre1启动子区域的H3K27Me3水平高于Kdm6bF/F小鼠，这些结果表明Kdm6b参与了TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs的凋亡、细胞毒性和发育过程的调控；

（5） 具体功能调控方面，作者首先发现Kdm6b缺失组与对照组相比，caspase3阳性TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs显著增加，Bcl2表达水平减少。Bcl2的表达受其第二外显子中存在的雌激素反应元件的影响，该外显子区域存在H3K27Me3修饰，ChIP-qPCR实验显示，Kdm6b缺失组小鼠雌激素反应元件区域H3K27Me3修饰水平高于正常组小鼠，而Bcl2启动子区域H3K27Me3修饰水平保持不变，这些结果表明Kdm6b能够通过促进生存基因Bcl2的表达来维持TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs的存活。其次，Kdm6b缺失组小鼠未成熟Thy1.2⁺TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs显著增多，Gzmb表达显著减少。IL15能够上调TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs Gzmb和Fasl的表达，但在Kdm6b缺失组小鼠IEL中Gzmb和Fasl表达降低且不能被IL15诱导，并且Gzmb和Fasl启动子区域H3K27Me3水平升高。同时利用体内肠癌模型和体外共培养实验表明Kdm6b缺失组小鼠TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs细胞毒性降低。以上结果表明Kdm6b对TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs的成熟和细胞毒性是必须的。

Fig 2. Kdm6b调控TCRαβ⁺CD8αα⁺ IEL基因的表达 

本篇文章作者通过单细胞转录组+V(D)J测序、bulk RNA-seq和CUT&Tag-seq，利用条件性敲除模型小鼠、流式、ChIP-qPCR等方法全面研究了小肠IELs的异质性和TCR多样性，并分析了Kdm6b对不同IELs亚群特别是TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs的发育、分化与功能的调控机制，揭示了Kdm6b介导的H3K27Me3去甲基化在维持肠道TCRαβ⁺CD8αα⁺ IELs的成熟、肠道归巢和细胞毒性功能等方面重要的调控作用。

Zhang H, Hu Y, Liu D, Liu Z, Xie N, Liu S, Zhang J, Jiang Y, Li C, Wang Q, Chen X, Ye D, Sun D, Zhai Y, Yan X, Liu Y, Chen CD, Huang X, Eugene Chin Y, Shi Y, Wu B, Zhang X. The histone demethylase Kdm6b regulates the maturation and cytotoxicity of TCRαβ⁺CD8αα⁺ intestinal intraepithelial lymphocytes. Cell Death Differ. 2022 Jan 9. doi: 10.1038/s41418-021-00921-w.

1. 2021年10大人类细胞图谱，及欧易生物单细胞的6件大事

2. 项目文章 | 单细胞客户文章持续不断！欧易单细胞测序助力解析气道goblet cell化生新机制

3. 项目文章 | 欧易单细胞测序客户利用5mC调控子分子亚型系统，描绘膀胱癌微环境特征并指导精准医疗

4. 项目文章 | NC来了！欧易单细胞转录组助力解析不同卒中类型介导的突触吞噬差异性

点击这里解锁更多精彩内容~

END

单细胞事业部  撰文

本文系欧易生物原创

欢迎转发到朋友圈

转载请注明文本转自欧易生物