项目文章 | 弗格森埃希菌通过其分泌msRNA 23487抑制肝脏PPARα表达从而诱发脂肪性肝炎

2021年12月9日，美国胃肠病学会主办的国际学术期刊《细胞与分子胃肠和肝脏病学》（Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology，IF 9.225）在线发表了上海交通大学医学院附属新华医院消化内科/上海市小儿消化与营养重点实验室范建高教授团队有关肠道菌群与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的又一项重要研究成果，“Escherichia fergusonii promotes nonobese nonalcoholic fatty liver disease by interfering with host hepatic lipid metabolism through its own msRNA 23487”。

该研究首次证实弗格森埃希菌（Escherichia fergusonii）在普通饮食饲养大鼠NAFLD发生发展中发挥了重要作用，并通过体内外试验发现弗格森埃希菌的作用机制部分是通过其分泌msRNA（miRNA-sized small RNAs) 23487、抑制肝脏过氧化酶体增殖物激活受体PPARα表达等机制，诱发肝细胞脂肪变、气球样变，甚至肝脏炎症损伤和纤维化。

文中的16s rRNA微生物多样性检测由欧易生物提供技术支持。

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是与遗传易感和胰岛素抵抗密切相关的慢性代谢应激性肝病，NAFLD及其严重类型非酒精性脂肪性肝炎（NASH）现已成为全球第一大慢性肝病，与当前全球肝硬化和肝细胞癌发病及病死人数逐年增加密切相关，有效防治NAFLD特别是NASH有望减轻全球沉重的肝脏疾病负担。高达50%的NAFLD患者并不肥胖，19%的NAFLD患者体重指数在正常范围（瘦人脂肪肝），非肥胖或瘦人NAFLD与肥胖相关脂肪肝患者同样有较高比例的NASH和进展性肝纤维化；为此，需要加强非肥胖/瘦人NASH的发病机制、无创诊断及新药干预靶点的研究。

1、埃希氏-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）与NAFLD疾病严重程度有关

为了确定NAFLD和NASH是否与肠道微生物组成的改变有关，收集健康对照(n=25)和NAFLD患者(n=29)的粪便样本进行了16S rRNA测序。PLS-DA显示，与健康对照组相比，NAFLD患者的肠道菌群组成发生了显著变化(Figure 1B)。在门或属水平上的相对丰度显示了NAFLD患者肠道微生物群的改变。NAFLD组的埃希氏-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）的相对丰度值明显高于健康人群组。与健康对照组相比，非肥胖NAFLD患者埃希氏-志贺氏菌属的相对丰度显著增加(Figure 1F)，表明埃希氏-志贺氏菌属可能在非肥胖NAFLD的发展中发挥致病作用。Spearman相关分析显示，埃希氏-志贺氏菌属的相对丰度与肝炎症(Adj R2=0.244, P < 0.0001)和纤维化(Adj R2=0.309, P < 0.0001)的发生有关(Figure 1G)。

图1 Escherichia-Shigella与NAFLD患者的疾病严重程度相关

2、Escherichia fergusonii改变了大鼠肠道微生物组

在大肠杆菌属中已鉴定出7种，其中Escherichia fergusonii是一种罕见的可同时感染人和动物的病原菌。采用fergusonii口服灌胃大鼠来研究其对大鼠肠道微生物组和生物学功能的影响。在门水平上，Escherichia fergusonii处理增加了Proteobacteria的相对丰度，降低了Bacteroidetes的相对丰度(Figure 2D)。LEfSe分析确定了一些最有可能解释组间差异的菌群(Figure 2E)。PICRUSt功能分析表明，与脂质合成和代谢相关的通路也被Escherichia fergusonii所调控(Figure 2F)。这些数据表明，Escherichia fergusonii通过改变肠道微生物群的分布来扰乱宿主代谢稳态，从而介导NAFLD进展。

图2 Escherichia-Shigella改变了大鼠肠道微生物组

3、Escherichia fergusonii调节宿主脂质代谢

为了了解肝脏脂质积累升高的机制，测量了脂肪酸和胆固醇代谢密切相关的生化指标。与生理盐水对照组相比，HFHC中甘油三酯、胆固醇、空腹血糖、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、同型半胱氨酸、总胆汁酸水平显著升高，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平下降。相比之下，Escherichia fergusonii提高了血清甘油三酯、胆固醇、空腹血糖、LDL-C、同型半胱氨酸和总胆汁酸水平，降低了HDL-C水平(Figure 3A-G)。同时评估了与脂质代谢相关的基因表达，Escherichia fergusonii增加了与脂肪再生相关的基因的表达，如Srebp1c、Scd、Fasn和Acc。与脂肪酸氧化(Cpt1a, Fabp1, Acadl, Acadvl)和脂质转运(Acsl1和Fatp2)相关的基因在Escherichia fergusonii处理或HFHC饮食中也被下调(Figure 3I)。这些数据表明，Escherichia fergusonii通过抑制脂肪酸氧化和提高脂质来扰乱宿主的肝脏脂质代谢。

图3 Escherichia-Shigella调节宿主脂质代谢

4、Escherichia fergusonii的msRNA测序分析

为了了解Escherichia fergusonii引起的肝脏脂质积累的机制，接下来对Escherichia fergusonii的产物进行测序。为了确定Escherichia fergusonii的msRNA谱，并研究其是否影响宿主的脂质代谢，对其进行了msRNA测序分析。在所有被鉴定的msRNA中，msRNA 15919和msRNA 23487的克隆拷贝数最高。生物学过程表明，Escherichia fergusonii的msRNA对宿主的肝脏代谢过程有明显的影响，包括脂质代谢(Figure 4B)。通过qPCR验证了msRNA的表达水平，处理后msRNA 23487的表达量最高且上调幅度最大。

图4 Escherichia-Shigella msRNA测序及qPCR定量结果

5、Escherichia fergusonii的msRNA 23487通过调节PPARα促进脂质积累

为了检测msRNA 23487表达的增加是否参与了宿主脂质代谢的调节，采用miRanda软件进行靶基因预测。其中PPARα被预测为msRNA 23487的靶基因之一。通过用msRNA 23487 mimic转染Huh7和HepG2细胞，来评估msRNA 23487对PPARα水平的影响。转染msRNA 23487 mimic后，msRNA 23487的表达水平显著升高；虽然Ppara mRNA水平无变化，但蛋白水平显著降低(Figure 5B-C)。

图5 Escherichia fergusonii的msRNA 23487通过调节PPARα促进脂质积累

NAFLD 患者粪便中大肠埃氏菌属-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)的丰度显著高于健康对照人群，且与NAFLD患者肝脂肪变、炎症损伤及纤维化程度密切相关，非肥胖的NAFLD患者粪便中大肠埃氏菌属-志贺氏菌属的丰度与肥胖的NAFLD患者之间无显著差异，两组都显著高于健康对照人群，提示肠道中大肠埃氏菌属-志贺氏菌属独立于肥胖参与NAFLD的发病。为了探究弗格森埃希菌诱导非肥胖NASH的机制，课题组通过对弗格森埃希菌（Escherichia fergusonii）进行msRNA（miRNA-sized small RNAs)测序发现，长期灌胃弗格森埃希菌的大鼠尽管体重与对照大鼠相似，但其肝脏弗格森埃希菌来源的msRNA23487水平显著升高。进一步通过体内外试验证实，msRNA 23487通过抑制肝脏PPARα等脂代谢相关基因的表达，导致肝脏脂代谢紊乱，从而诱发肝细胞脂肪变性和脂毒性。 

文章链接：DOI: 10.1016/j.jcmgh.2021.12.003

本文的第一作者是上海交通大学医学院附属新华医院内科基地住院规培医师信丰智博士，共同通讯作者为上海市儿科医学研究所姜璐博士和新华医院消化内科范建高教授。本研究得到了国家科技部精准诊疗课题、国家自然科学基金面上项目以及上海市领军人才计划的资助，得到了上海市儿科医学研究所所长/上海市小儿消化与营养重点实验室主任蔡威教授的大力支持和无私帮助，以及张炜真教授、赵力平教授等的指导。

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Nancy  撰文

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