离子色谱筛选系统与计算机建模结合用于生物药方法开发和优化

2022-06-29 06:37:17, ACD/Labs 李丹译 Advanced Chemistry Development, Inc. (ACD/Labs)

前言

该文是对Merck科学家发表的文章的部分翻译，该文章介绍了创建自动化的IEX方法筛选平台结合软件建模功能用于多肽，核苷和蛋白质类样品的分离分析。本文是对文章的部分的翻译，完整信息请阅读全文。

摘要

随着生物药领域的发展，越来越具有挑战性的疗法和疫苗生产工艺，需要相应分析水平的创新以提供跨职能领域的关键分析参数。几十年来，色谱法已经成为制药行业首选的分析工具，用于从多组分混合物中分析和分离目标物(如原料药、中间体和副产物)。相较于其它分离技术(如RPLC,HILIC, SFC等)，离子交换色谱(IEX)由于其独特的选择性，且在分离过程中不会导致蛋白质变性，广泛用于生物制药的分析和纯化。然而，IEX方法的开发仍然被认为是色谱中最具挑战性和最费力的方法之一，因为涉及许多变量，如:洗脱机制(通过盐、pH或盐介导的pH梯度)，固定相的性质(正电荷或负电荷;强或弱离子交换器)，缓冲类型和离子强度以及pH值的选择。在此，我们介绍了一个由多柱IEX筛选系统结合计算机辅助模拟的新的工作流，用于高效的生物药物开发和纯化方法。自动筛选系统可同时配置12个不同的色谱柱和24个流动相，以直接的自动化方式连续操作，用于阳离子和阴离子交换模式(分别为CEX和AEX)。最佳和稳健的操作条件是通过计算机辅助建模，使用现成的软件(ACD Labs/LC-Simluator)，实验和模拟保留时间的差异小于0.5%。此外，自动馏分收集也被纳入该流程，用于说明在核苷酸、多肽和蛋白质的分离、分析和纯化方面的实用性和易用性。

引言

在过去的十年中，生物制药目标大幅增长，因为它们在领先行业的研发组合中逐渐占据了更大的比例。多肽、(寡核苷酸)、蛋白质生物制剂和疫苗对开发和生产带来了许多挑战，包括复杂的含量分析和多步骤纯化。与小分子相比，由于其更高的分子尺寸(高达数百kDa)和更高的复杂性(更高的有序结构)，这些挑战需要更适合其性质的分析和制备方法。在分离方法方面，分析科学家有几种选择。液相色谱(LC)本身已确立为参考技术，提供了不同的分离模式:反相液相色谱(RPLC)，亲水相互作用色谱(HILIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、尺寸排除色谱(SEC)和离子交换色谱(IEX)(1,5,7,11-14)。后者在历史上被广泛用于分析和纯化生物制药。

由于IEX根据分析物所带电荷的数量和种类，以及分析物与固定相上离子交换剂之间的亲和力实现不同物质的分离。这样的分离模式使得IEX成为RPLC或HILIC补充分析技术。根据固定相上离子交换剂上所带电荷的种类，可以细分为阳离子交换(CEX)和阴离子交换(AEX)。IEX已证明其在各种生物制药应用中的有用性，因为这些产品含有不同pKa或pI值的杂质。因此，通过改变pH值或盐浓度，或同时改变两者，可以成功实现不同物种的分离（22-25）。此外，IEX为生物制品的纯化生产提供了独特的优势，因为IEX所用的色谱条件不会使蛋白质变性，相比RPLC、HILIC、SFC和其他依靠高含量有机改性剂的分离技术（5、26）。

IEX方法的开发通常是复杂和耗时的，因为必须考虑许多因素(27-30)。此外，在分析复杂的生物基质时，还存在与仪器相关的其他挑战，包括持续使用高盐和高缓冲液浓度，以及非生物惰性LC设备的兼容性差。在这种情况下，因此最先进的仪器和柱技术的自动化筛选工作流程的引入将不可否认地减少费力的IEX方法开发工作。进一步优化该流程可以通过部署新的平台来实现，将多柱筛选和计算机辅助优化技术相结合(31)。除了促进IEX方法在生物制药领域的发展外，自动化筛选工作流和计算机优化的结合使用还可以简化目标分离和表征(如杂质、变体、共制剂等)，并集成多重检测和自动化馏分收集。

在此，我们介绍了一种自动化IEX筛选系统，该系统可以在生物惰性LC仪器上使用多种色谱柱和洗脱液组合，以简化IEX分析方法的开发(包括CEX和AEX)。利用现成的模拟软件和馏分收集，将这种筛选设置与软件优化相结合，实现了在分离、分析和纯化生物分子(核苷酸、多肽和蛋白质)方面的实用性和易用性。

色谱柱

共选取了12根离子交换色谱柱，包括6根阳离子交换和6根阴离子交换。

分析样品

Mixture 1由10种核苷酸组成的混合样品。

Mixture 2由五种肽组成的混合样品。

Mixture3由四种蛋白组成的混合样品，分别是核糖核酸酶A，细胞色素C，全转铁蛋白和无肌酸血红蛋白。这三种不同类别的多组分生物分子的混合物通常是生物制药研发中经常遇到的。

结果与讨论

在12根色谱柱上分别探索了不同的8个pH值(从3到10，采用单位增量)，并使用一般的盐梯度进行分析，因此配置了8种不同的酸碱缓冲盐种类。为了解决不同缓冲盐之间的兼容问题，用99%纯水(Channel C)和1%2M NaCl(Channel D)设定了冲洗程序，并且(1M NaOH; 1M NH4OH; 1M HCl)通道用于色谱柱再生。Channel A中放酸性buffer，Channel B中放碱性buffer。采用的盐浓度梯度程序，并且保证流动相pH不变。梯度程序如下图所示：

由于IEX高度依赖于流动相的pH值，方法筛选时必须考察大量的缓冲液来覆盖尽可能宽的pH值范围。因此，在Channel A和Channel B上分别配置了两个溶剂切换阀，可以同时放置24种不同流动相。仪器配置如下图所示：

图1.仪器系统配置

越来越多的文章表明，目前的LC仪器(存在金属)对于分析含有富电子和螯合剂的复杂样品基质的适用性较差，这种情况更多的是生物制药研发中遇到。为了应对这些挑战，仪器制造商创造了“生物惰性”系统，该系统还可以处理高缓冲液和高盐含量的流动相洗脱液。

每组样品分别在12根色谱组和8个pH下进行实验，单组样品共96针数据。下图总结了对三种样品混合物进行广泛筛选的实验结果。以颜色的方式进行标记，可视化的显示每种混合物共96针样品的结果。绿色方框表示所有混合物组分完全基线分离，分离度值为1。逐渐向红色的颜色过渡表示共洗脱或不完全分离的次优结果(R值<1)。标有星号的方框表示每种混合物的pH和柱的最佳组合。

图2.筛选结果

从图2中可以看出，在阴离子交换柱上对于核苷类混合物的分离比在阳离子交换柱上的分离效果好。采用强阴离子交换柱(C8:Tosoh TSKgel BioAssist Q)，在pH8下的50mM Tris-HCl体系下，10种核苷类物质基线分离。考虑到10种核苷酸存在不同的可电离基团(图1)，这在一定程度上是意料之中的，它们都具有一个或多个磷酸基，但不是所有的磷酸基都具有负电荷位点。其中有几个关键对，如核苷酸2-3(ATP-cGMP)、4-5(GMP-dCMP)和9-10(dCTP-UTP)(图4)，这使得分离非常具有挑战性。

而对于多肽类混合而言，在阳离子交换色谱柱上分离较好。与核苷类物质不同，在阴离子交换色谱柱上也有分离比较好的色谱参数。但在阴离子交换柱上总体的分离比在阳离子交换柱上差。

混合物3由4个蛋白质样品组成，分子量高达77kDa(全转铁蛋白)。当IEX分析这些分子时，与小分子(如小肽或核苷酸)相比，它们表现出了一些不同的行为。随着样品尺寸和复杂性的增加，分子表面的电荷数量也会增加，这是IEX中保留和洗脱行为出现一些偏差的主要原因之一(15)。因此，在使用小分子和大分子系统时，考虑这些差异以避免性能损失是至关重要的。在生物惰性系统上的筛选也证明了在AEX和CEX条件下分析蛋白质(16-19)的优异结果(图3)。

图3列举了3种混合物分离较好的的色谱条件及对应的色谱图。

图3. 典型图谱

计算机模拟辅助建模

通过筛选实验获得一个良好的起点，为了确定最终的方法参数，接下来用多肽样品借助软件的建模功能，构建了梯度& 温度&pH的3D模型。

图4 a). 3D模型 b).软件预测最佳条件下的预测谱图与实际谱图的叠图

采用IEX-UV结合馏分收集的方式实现目标组分的小规模纯化

图2中强调的平台不仅用于筛选目的，而且作为一个能够进行生物样品分离和收集的系统。这种能力对于识别和表征的不同目标生物制药模式(如所需的原料药、中间体、杂质、生物工艺变体等)具有很高的价值。因此，IEX筛选平台的概念是非常方便和有效的，在方法开发阶段同时能够通过一个组分收集模块进行样品分离纯化，。此外，计算机辅助工具可以进一步提高这两个过程的效率。

图5

图5描述了分离混合物2中所需要的肽(val-tyr- val)。该肽的分离是通过筛选结合软件优化实现的。使用相同的生物惰性系统结合自动则分收集模块，将相同的条件用于val-tyr–val肽的分离。如图5所示，即使注射量很大(50µL)，混合物中所有其他成分和val-tyrn-val的分离度仍然满足要求。一旦组分收集完成，随后重新分析纯化后的样品，结果表明该肽被有效分离(纯度>95%)。这个结果说明了这个平台的强大和多功能性，不仅用于方法开发，也能达到分离制备的目的。