pKa 的黄金规则探讨

进行离子型化合物的液相方法开发时，大家经常提到要规避pKa正负1的范围，甚至说要规避正负2的范围以取得良好的峰形和稳定的保留。对于这个规则，我个人一直认为应该有一个明确的应用范围的澄清。如果能够把其应用范围有一个明确的界定，这个规则是很有用的，但如果这个规则被外延使用，反而有害。

但今天的这篇文章是来挑战这个黄金规则的合理性的，这个规则看上去含金量很低。我们先拿一套实验数据来讨论这一点。

图1.对某碱性化合物的pH扫描实测图形叠合图

这是刘国柱博士在实验室用多流路的安捷伦筛选系统做的从2到11.3的pH扫描图，收集这个化合物的所有谱图来比较分析。能看到这个化合物的保留分成两个稳定期，一个变动期。从结构上来分析，这个化合物有两个碱性解离基团，一强一弱，预测最强碱性pKa来自于脂肪胺，pKa为8.0，芳香环上的氮的pKa预测值为2.1。从峰形上进行考察最强碱性pKa附近的色谱峰，pH8.2的色谱峰峰形很好，同旁边pH9.2-11.3的三个pH下的峰形几乎不相上下。从色谱峰的稳定性来说尚可接受。再看pKa左侧的色谱峰，明显pH7的峰形质量下降了，而5.8下降的更厉害，酸性越强，峰形越差。而且色谱峰的保留时间彼此差距拉开，也就意味着pH的微小变化都引起保留时间较大变化。因此，从这个化合物来说，黄金规则似乎完全失效了。失效的规则，那也就不是黄金了。

首先,我们从峰形角度来讨论，显然图型上是有规律的，我们看到可电离的碱性化合物在它不带电荷的状态下峰形最好，带50%电荷的时候，峰形也尚可，带电荷的比例越高峰形就越差，峰高也降低。等到化合物完全电离了，则色谱峰呈超载的直角三角型状态。这种现象实际是带电化合物完全电离后的与色谱柱的吸附能力大大降低而导致的现象。完全解离的碱性化合物超载质量远远低于中性化合物，约为1比50，图2的去甲替林的案例也说明了这一点。

图2.完全电离化后的去甲替林的超载峰形态,从右到左为0.01-5ug去甲替林的峰。色谱方法：150mm*4.6mm(3.5um) Xterra MS C18柱 28%ACN 20mmol/L 甲酸 pH2.7

总结一下，碱性化合物的峰形跟pKa没有什么直接关系，跟化合物的带电荷的状态有关系，完全电离的碱性化合物峰形往往较差。如何在酸性条件下修饰碱性化合物的峰形，事实上有很多手段，可以从色谱柱，修饰峰形的添加剂，温度等手段着手，我们在这里不做展开。

其次我们从保留时间的稳定性来进行探讨。图1实验的数据，以保留时间以及保留因子的对数和pH作图，图形都是一个S型，如图3-1和3-2所示。这个图形和logD和pH作图相关性很高，如图4所示，这说明物质保留的主要的作用力就是疏水作用力。

图3-1.刘国柱实验 pH和保留时间相关性图

图3-2.刘国柱实验pH和保留因子的对数的相关性图

图4.碱性化合物的典型的pH-logD曲线

图5.pKa与logD曲线同坐标系下分析

pKa点上的疏水性大小等于分子态的logD大小减去log0.5，因为在pKa点上只有50%的分子态，另外50%是离子态，离子态的疏水性相较分子态非常低，忽略不计，而log0.5约为0.3，pKa电上的logD疏水性比分子态下降0.3，保留会减弱，但是变化不是特别大。而从图5上可以看到，pKa点向左约3个pH单位，即5-8，logD的变化剧烈，其与图1里的实验数据也是吻合的。也就是说真正的保留时间的快速变动期是发生在当前pKa向左3个单位的范围内，黄金规则的负2也不够用。

图6.教科书上的反相色谱保留时间和pH的关系图

有些教科书里会引用这样一个pH-保留时间图型，例如现代液相色谱导论的第七章的图7-2（图6），图作者猜测pKa为保留时间的S曲线的中心点的pH上。按照上文的做的解释，这张图的pKa等于5.0的猜测是错的，pKa很有可能是在6以上，因为上文已经说明pKa点不是保留时间变化最剧烈的点。和图1的保留时间图形进行一下对照，就可以分辨出来，这张图的结论推断有误。如果基于施耐德先生的这张图而衍生出了黄金规则，这个规则就一直是错误的，不符合实际情况。

还有人有过这样的顾虑，在pKa附近开发方法是不是特别容易出双峰，其猜想是因为分子态和离子态比例很接近，所以容易出两个峰。在pKa点上，物质的分子态和离子态各50%，它不是说这50%是固定化的，如果是某一部分永远就都是带电的，那这一部分的保留会很弱，另一部分是分子态，其保留会很强，这两者分别能出峰的话，其保留时间将相差很远。物质的电离速度是非常快速的，快到纳秒级别，因此根本就不可能用色谱观察到分子态和离子态的区别。双峰的电离假说是错误的。

我们做一个结语：那到底该用什么样的规则？对于反相色谱分析可电离的物质来说，如果追求峰形好，力争让分子处于分子态，而非电离态；如果追求出峰稳定，将pH选在完全分子态以及其附近或者选择完全电离态，完全电离态显然要注意如何修饰峰形；如果追求分离效果，调动色谱峰的位置，改善分离，物质应该处于部分电离态；以疏水作用为主的反相色谱研究，应当注意规避化合物的疏水性变动区。至于pKa的黄金规则，我认为可以不看。

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