项目文章 | 迈维靶向检测助力江西农大黄路生院士团队发表宿主基因影响肠道菌群的重要成果见刊nature

●发表单位：江西农业大学

●发表期刊：nature

●影响因子：43.07

●发表时间：2022.04.27

2022年4月27日北京时间23:00，江西农业大学猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室黄路生院士团队在《nature》上在线发表了题为“ABOgenotype alters the gut microbiota by regulating GalNAc levels inpigs”的文章，发现ABO血型基因通过调节N-乙酰半乳糖胺浓度显著影响猪肠道中丹毒丝菌科相关细菌的丰度，并系统地阐明了其作用机理。中国科学院院士、中国畜牧兽医学会理事长黄路生、江西农业大学首席教授陈从英、江西农业大学引进专家米歇尔∙乔治教授为文章共同通讯作者，江西农业大学杨慧博士、吴金鸳博士为文章共同第一作者。迈维代谢为本文提供了靶向开发及靶向检测N-乙酰半乳糖胺的分析服务。

不同个体肠道菌群的组成不同并且与健康密切相关，宿主的遗传变异是如何影响其自身的肠道菌群的组成是研究热点，也是难点。本文用家猪为研究材料，用12年的时间构建了一个由全世界八个不同的商业品种及中国地方猪种混合杂交而成的嵌合家系第六及第七世代群体，同时通过严格控制饲料、饲养、健康及环境条件，从不同的角度阐述了这一难点问题。

通过对两个世代（F6和F7）1500个实验个体，在第25天(哺乳期)、120天(生长期)和240天(屠宰日)收集粪便，并在240天收集盲肠和回肠内容物(F6和F7)和盲肠和回肠粘膜刮片(仅F7)(7个样本类型，12个数据系列),测定每个个体三个肠道部位（回肠、盲肠、粪便）的肠道细菌组成。12个数据系列的肠道微生物组成表明，F6和F7具有显著的一致性，但样本类型之间存在显著差异(图1a和b)，回肠内容物低于盲肠内容物和粘膜(图1c)。β多样性与α多样性呈负相关，第25天高于第120天和240天。同时发现，回肠内容物具有最低的α多样性(图1d)。

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图1 健康猪的肠道菌群

通过对实验猪只的饲料、饲养、健康及环境条件的统一标准管理，在F6和F7两个世代中分别鉴别到1050和955个细菌分类（OTU和taxa）可遗传，最高遗传力可达0.598（YRC22属），450个可遗传的细菌分类在F6和F7两个世代中被重复验证，并且部分可遗传的细菌分类与人类肠道中的研究结果相一致，如Christensenellaece在人和猪中都具有高的遗传力，由此证明肠道菌群的组成是可以遗传的。

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图2 马赛克猪群的肠道微生物群组成的遗传性

本研究对两个世代1430个嵌合个体进行全基因组重测序，共鉴别到3000多万个宿主基因组变异（即基因组上每100bp就有1个变异）。基于上述高度遗传变异的实验群体，对检测到的8490个细菌分类进行了全基因组关联分析，共检测到1527个显著影响846个细菌分类的丰度或存在与否的宿主基因组变异位点。在一个队列中发现了六个超过实验范围发现阈值(1.5x10−12)的信号，在另一个队列中超过了实验范围复制阈值(0.007)(图3a)。所有先导SNP都定位在3037个碱基对内(1号染色体)，并处于高LD(图3b)。它们影响了两个OTU(OTU476和OTU327)以及OTU476被归类的p-75-a5属，这三种都是丹毒科。为了确定这个miQTL是否影响其他分类群，我们绘制了先导SNP1_272907239和所研究的8,490个OTU的F6和F7关联日志(1/p值)。OTU476和OTU327表现突出，在F6和F7中达到极显著水平(图3c)。然而，31个其他p-75-a5OTU和83个其他ErysipelotrichaceaeOTU的p值在两个队列中都显著向较低的p值移动(图3c)。

所有先导SNP都定位于猪N-乙酰-半乳糖基转移酶基因的3‘端，这是人类ABO血型的基础(图3b)。通过对F6及F7两个世代大样本家猪的系统遗传解析，鉴别到家猪ABO血型系统中一个350万年前包含第8外显子的2.3kb缺失变异，这个基因缺失变异直接导致了家猪肠道中丹毒丝菌科相关细菌的丰度差异（3d）。对300个F7盲肠组织的全基因组转录本分析表明，该2.3kb的缺失突变导致ABO基因中一个具有可变第8和第9外显子的7.4kb转录本表达量只有正常转录本的1/3，而且这个转录本编码的蛋白质丢失了62%的氨基酸序列（包括7/8的活性位点），导致ABO蛋白的N-乙酰半乳糖胺转移酶失去活性。基于嵌合家系群体的祖代八个家猪品种、亚洲野猪、欧洲野猪、苏门答腊野猪、菲律宾疣猪、印度尼西亚爪哇疣猪和非洲普通疣猪，对这个ABO基因2.3kb缺失进行溯源，发现这个2.3kb的基因缺失突变在所有的祖代八个猪种、亚洲和欧洲/美洲野猪以及印度疣猪中均有存在而且突变的断点序列在所有样本中一致，从而证实猪属中的这个ABO基因2.3kb缺失属于古老突变并存在平衡选择。

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图3 影响丹毒科植物的miQTL(microbiota )

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图4 猪ABO同源基因中My-old的缺失导致了miQTL

在屠宰测定的278头实验猪中，使用靶向代谢组方法测定AA、AO和OO基因型个体盲肠内容物中N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）浓度，证实ABO血型显著影响肠道中N-乙酰半乳糖胺浓度。同时在对屠宰测定的278头实验猪分析盲肠中N-乙酰半乳糖胺浓度和受ABO血型影响的丹毒丝菌科相关细菌丰度的关联性，发现即使是在同一种基因型的个体间盲肠内容物中N-乙酰半乳糖胺浓度和丹毒丝菌科相关细菌丰度仍显著相关，表明ABO血型是通过影响肠道中N-乙酰半乳糖胺浓度从而影响丹毒丝菌科相关细菌丰度。

使用C13标记的GalNAc饲喂体外培养的受ABO血型影响的丹毒丝菌科菌株，在培养13小时后收集菌体培养物进行C13标记的代谢物测定，发现GalNAc的代谢产物如三磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮都被C13标记，该代谢流实验进一步证实了受ABO血型影响的丹毒丝菌科菌株能够利用GalNAc。进一步进行小鼠实验，将10只无菌昆明系母鼠同时灌喂分离培养的受ABO血型影响的丹毒丝菌科菌株和对照的大肠杆菌菌株，平均分成两组分别灌喂200mg/kg体重的GalNAc或对照的无菌PBS，于第12天测定实验小鼠盲肠中丹毒丝菌科菌株和对照的大肠杆菌的丰度，证实添加N-乙酰半乳糖胺GalNAc会显著影响肠道中丹毒丝菌科相关细菌丰度，而对照的大肠杆菌丰度则不受影响。

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图5 miQTL通过增加GalNAc浓度起作用并影响GalNAc利用细菌

利用体外培养基培养分离的目标丹毒丝菌科菌株，添加糖胺促进了目标菌株生长；收集并测定菌株转录组分析表明，受ABO血型影响的丹毒丝菌科菌株与GalNAc转运和代谢相关的操纵子样基因簇一直处于表达状态，与是否添加N-乙酰半乳糖胺诱导无关；而对照组的大肠杆菌菌株则是在添加N-乙酰半乳糖胺诱导后表达。GalNAc在4-8-110菌株中的表达模式介于大肠杆菌和4-15-1之间：GalNAc基因在没有GalNAc的情况下表达(尽管水平较低)，但在它的存在下表达上调(~5-10倍)(图6a)。OTU476类菌株的转录组对GalNAc添加的反应与大肠杆菌反应的差异并不局限于GalNAc操纵子。虽然GalNAc的添加对大肠杆菌GalNAc调节子以外的基因没有明显的影响，但它改变了4-15-1和4-8-110中≥605和225基因的表达(Q≤0.05)(图6b)。在两个菌株中，有6个KEGG途径因此受到干扰(FDR≤0.05)：代谢途径、嘧啶代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、抗生素的生物合成、ABC转运蛋白和次生代谢物的生物合成。

图5 MiQTL反应细菌的GalNAc操纵子组织和转录组反应

本研究历时十二年，通过对两个世代1500多个个体，每个个体三个生长阶段和三个肠道部位共5100多个样品的系统研究，有力证明宿主遗传会影响肠道菌群的组成和丰度。发现并验证ABO血型基因的一个350万年前的2.3kb缺失导致家猪肠道中N-乙酰半乳糖胺浓度的降低，从而使其丹毒丝菌科相关细菌丰度的下降。

靶向代谢组学，针对特定某一物质或某一类代谢物进行检测的代谢组学方法，以标准品为参照，利用多反应监测(MRM)技术对目标代谢物进行准确的定性定量分析。靶向代谢组学具有特异性强，灵敏度高和定量准确等特点。