如何长效抑制miRNA ——miRNA sponges 必须了解下

microRNA (miRNA) 广泛参与调节动物的发育过程、生理反应和病理，通过与编码基因mRNA的互作调控后者的表达，再加近几年参与非编码基因(lncRNA、circRNA)-miRNA-mRNA的ceRNA网络，又催生了miRNA的研究热潮。

分子的机制研究少不了对其在细胞或者动物水平进行过表达或者抑制处理，以观察功能学的变化。miRNA的上调通过化学合成成熟体（minics）或者借由载体构建出pri/pre前体剪切出成熟体达到目的，下调同样有多种方式：

（1）基因敲除：详情见<< miRNA 下调新方法：教你如何摆脱 QPCR 检测无效>>，miRNA可通过Crispr/cas9破坏成熟体或者前体颈环结构达到完全消除miRNA的目的，也只有此方法适用于通过QPCR检测RNA水平的丰度。

（2）反义核苷酸：基于化学合成的inhibitor，以及基于质粒或者病毒借由U6启动子表达出来的，都属于miRNA成熟体的反义互补序列，特点是合成方便，构建简单，算是miRNA下调的标准方法，缺点是无法通过QPCR检测下调丰度。

（3）海绵体：顾名思义，就是能够像海绵吸水一样能够吸附众多miRNA的分子，典型的海绵结构包含 4 到 10 个miRNA结合位点，每个结合位点在中间位置包含错配，以避免受到 Ago2 介导的核酸内切酶的影响（完全互补的海绵也可以起到抑制活性，但其本身容易被降解，因为完全互补的miRNA就等于是siRNA效果）。

a. 解决了miRNA的反义序列含有连续4个T而无法设计的问题，诸如hsa-miR-548bb-5p（AAAAGUAACUAUGGUUUUUGCC），其反义序列因为含有连续的T，会导致三型启动子U6、H1无法完成转录，从而难以构建抑制序列，sponges则对启动子的选择无任何偏向性；

b. 解决三型启动子在一些特殊细胞无法表达的问题，如需要诱导表达、特异性表达，还得依靠常见的二型启动子驱动；

c. 可以构建串联的海绵，同时敲减不同的miRNA，若要同时敲低多个miRNA，海绵体可以在一条长链同时表达不同miRNA的结合序列，这是其他两种做不到的；

d. 长效抑制：错配形式的sponges设计导致其吸附序列无法对其切割，加之二型启动子表达的sponges含有polyA尾，因此相比较于inhibitor，sponges存在时间更长，抑制更加稳定。

对于许多研究应用，海绵还提供优于化学修饰的反义寡核苷酸抑制剂的优势。可以注射到小鼠体内的胆固醇修饰的“antagomir”寡核苷酸不能进入所有组织，并且大部分积聚在肝脏中。而且，antagomir 需要大剂量重复给药以长期抑制 miRNA，而sponges可以产生种系转基因海绵表达动物，以在动物的一生中持续抑制感兴趣的 miRNA。

DU等人使用具有 CD4 + T 细胞趋向性的慢病毒 miR-326 海绵，并通过尾静脉注射实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE)（多发性硬化症模型）的小鼠将其输送到血液系统。海绵处理减少了T 辅助细胞（T H -17 细胞）的自身免疫性 IL-17 的分泌并改善了 EAE 的组织学症状。

Starczynowski 等人为了模拟造血干/祖细胞中miR-145 和 miR-146a两种 miRNA 的部分丢失，使用包含每个 miRNA 的 8到9 个凸起位点的组合海绵。用逆转录病毒携带黄色荧光YFP为报告基因的海绵转导细胞，并移植到受致命照射的小鼠中，并与野生型细胞混合以模拟人类 5q-患者的嵌合体。移植后八周，动物的血细胞表现出骨髓增生异常综合征的大部分特征。

诚然，每种技术都有其局限性，海绵可能由于其在细胞中的高丰度引发非特异性与其他分子的互作；海绵是否吸附了miRNA、以及吸附了多少的miRNA，是未知且无法直接验证的。总之，海绵是一种较为行之有效，且在特定领域唯一满足下调miRNA的技术，借由质粒、慢病毒、腺相关病毒搭配各类型启动子满足从细胞至动物的各场景实验运用，吉凯基因提供一条龙设计、构建、包装病毒的服务，快来咨询吧！！！

【参考文献】

1.MicroRNA sponges: Progress and possibilities；

2.Identification of miR­145 and miR­146a as mediators  of the 5q– syndrome phenotype

3.MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis