2022-05-20 12:40:48, Snyder Advanced Chemistry Development, Inc. (ACD/Labs)
问:在反相色谱(RPC)中,经常听说疏水作用,那么什么是疏水作用?
答:在反相色谱中,特别是使用烷基键合相(如C18,C8,C4等)作为固定相时,疏水作用是其中最重要的保留机制(很多情况下没有之一)。溶质分子在固定相里的定位可能会以任何方式发生,如图1所示(固定相为C8),(a)为疏溶剂作用(solvophobic interaction)示意图,也就是溶质分子与固定相的键合基团对齐并且吸附在它的上面,(b)为吸附(adsorption),也就是溶质分子并没有渗透到固定相里,而是保留在固定相和流动相的界面之间,(c)为分配(partition),认为固定相和流动相类似,溶质分子会溶解在里面,而此时的固定相的更准确的理解是键合相及其吸附的部分流动相,比如C8会倾向性地把水/乙腈这种流动相中地乙腈萃取出来,然后在其表面富集,从而形成新的“固定相”。
图1 溶质分子在RPC中的不同的保留机制。(a)疏溶剂作用;(b)吸附;(c)分配;(d)8种氨基酸在RPC中保留的比较(C8,水性缓冲液pH 6.7,70℃)
当讨论RPC的保留机制时,Horvath的疏溶剂作用模式经常被引用,也就是疏水性的溶质分子比较喜欢吸附在疏水性的烷基上,因此也叫“疏水保留”。研究发现RPC的保留与溶质在辛醇和水之间的分配系数P(也就是常说的酯水分配系数)有关,这也说明分配过程是解释RPC保留机制的最好方法。但是当样品成分的分子结构比较多样化时,就会如图1(d)中的那八种氨基酸那样变得不那么明显,因此分配原理来解释反相保留行为还存在一定的局限性。
早在20世纪80年代早期,有人发现各种同系物(CH3-[CH2]n-1-X)的RPC保留结果令人惊讶(这里的X代表一个官能团,比如-OH或者-CO2CH3):logk对碳数量n的作图结果显示出不连贯性,如图2所示:
图2 保留作为烷基链长度的一种函数关系(同时对于溶质分子和柱子,90%甲醇-水,25℃)
这种反常的行为可以用图3来形象地解释,也就是当溶质分子的长度超过键合的烷基时,溶质分子中连续性的-CH2-基团对保留的贡献就变得很小,因为超出固定相键合的烷基的部分(如图3中红色虚线圈出的部分)可能会折返到固定相上或者进入固定相内部,但是无法如图1(c)一样完全渗入固定相或者如图1(a)一样完全附着在键合的烷基上,因此溶质分子和固定相的相互作用就会减少,因此“突出在”固定相之外的-CH2-基团的保留也会相应地减少。同系物的每个-CH2-对于保留的贡献被定义为αCH2,并且这个值一般假设是恒定不变,然而对于被排除在固定相键合相之外的-CH2-,其αCH2的值也会更小一些。图2中,对于C18,C8和C6,分别在n=n''=18,8和6时出现很明显的断点(垂直的虚线),表明小溶质分子可以渗入C18,C8和C6的键合相中,而不只是如图1(b)所示的吸附。
图3 (a)log k和同系物样品CH3-[CH2]n-1-X的数量n的坐标图(C8);(b)不同n的溶质分子在C8中作用示意图
由于很多的原因,RPC的具体保留机理很可能会随着使用的色谱柱、溶质分子和实验条件的不同而不同。Horvath很早就预测出这个问题,他特别指出“非极性的溶质分子在RPC里的分配和吸附过程是明显不同的,但是这个不同却没有明显的热力学或实际意义,因此这个问题不值得进一步研究”。在实际的工作中,我们将RPC中可能同时存在的如图1中所示的疏溶剂作用、吸附和分配统称为“疏水作用”,疏水作用主导下的保留行为随着流动相组成(B%)的变化而变化也有一个实用的经验公式:
其中kw指(使用外推法)0%B时k的值(水作为流动相),当只有%B发生变化时,S对于一个给定的分析物来说时常数,Φ是流动相(Φ=0.01%B)中有机溶剂B的体积分数。
总结一下,RPC的保留机制很复杂,其中经常占主导的“疏水作用”也可以细分为疏溶剂作用,吸附和分配等,但是在实际工作中很难、也没有必要深究。疏水作用也可以用简单的经验公式来指导实际工作。
参考文献(本文几乎全部来源于如下专著,推荐大家多阅读学习)
L. R. Snyder, J. J. Kirland, Introduction to Modern Liquid Chromatography 3rd. 2010, John Wiley & Sons, Inc.
07-01 英斯特朗
连载 | 药物一致性评价与粒度分析(三)07-01 欧美克仪器
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