BioTek应用大揭秘: Comet assays也能实现高通量检测

当单细胞划过柔软适中的凝胶，拖出美丽的彗星尾巴，学艺术的她可能在欣赏这美丽的线条和色彩，可是读生物的你却在发愁如何通过测量这漫天星辰般的小彗星而获得DNA损伤的数据...

如果您是肿瘤遗传研究领域的科研工作者，或者是环境行业的“白衣天使”，也有可能您正在食品安全的行业辛勤耕耘，亦或您只是一位初涉生物行业的莘莘学子，当您需要进行大量的彗星实验时，也许完全没有心情去欣赏一个个细胞形成的美丽彗星，而苦恼于如何轻松有效的获得Comet assay的定量分析结果、以及冗繁的一批又一批实验样品的重复操作。

今天我们要揭秘的就是BioTek联合Trevigen®  CometAssay® 推出的高通量自动化基因毒性检测解决方案，下面我们首先正式介绍一下CometAassy：

彗星试验(Comet Assay)又称单细胞电泳（Single cell gel electrophoresis，SCGE）是由Ostling在1984年首次提出，是一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法。由于该方法所需设备简单，试剂花费少且兼具快速、灵敏的优点，彗星试验被广泛应用于生物学、临床和毒理学等科研领域（图1）。但是传统的彗星实验在图像获取和数据分析方面基于普通的倒置荧光显微镜，通量很低并且需要大量的重复性劳动，而精确的图像定量分析则需要专业的CometAassay等分析软件，获取和操作均有不便。基于BioTek的Cytaiton®系列及最新推出的Lionheart FX®智能细胞成像平台，能够非常好的解决以上诸多问题，轻松实现单通量至高通量的基因毒性检测。

图1，Trevigen®  CometAssay®联合Cytation&LionheartFX简要操作步骤：1.将细胞核低熔点琼脂糖（LM Agarose ）在37℃混合。2.在CometSlide™或CometChip®上固定细胞。3.使用裂解液处理细胞（去除细胞膜及组蛋白）。4.使用碱液处理样品（DNA解链及变性）。5.使用SYBRGold 标记样品，后续进行碱性单细胞电泳，结果置于Cytation中进行检测，用于评估DNA损伤。

Trevigen提供多种规格和通量的的CometAssay测试耗材，包括2个或3个的玻片载位和96个样品通量的芯片载位。同时BioTek的Cytaton平台和Lionheart FX平台均有对应此各种规格的适配器（图2）。能够对不同样品电泳后的Comets实现全视野拼接成像，特别是96孔板的高通量样品，设置简单程序后就能够对每个样品自动成像。获得高清晰的彗星实验图片（图3）。

图2，Comet Assay规格及Cytation对应适配器

图3，Cytaiton自动化成像系统对2-well，3-well和96well规格的CometAssay样品成像结果。可以看出，上排DNA无断裂损伤的样品，每个细胞呈现圆形，而有DNA损伤的样品则有明显的彗星状拖尾。

得到了清晰的图像之后，如果需要测定DNA损伤的情况，就必须要进行精确的图像分析。通常来说，DNA损伤用于评估基因毒性需要测定两个指标：% DNA in Comet Tail（慧尾DNA%） 及 Tail Moment（尾距）。这两个指标均需要对原始Comet图像进行多参数的定量测定，可能您会自学image J等开放平台的分析软件，也可能会购买专业的CometAassay分析软件，或者在各种论坛上求助等等，但是这些都会浪费许多不必要的精力，实现自动化分析方面也较为困难，那么通过Cytation和Lionheart FX配套的Gen5软件将如何实现呢？

图4可以看出，Gen5的图像分析能够清晰的对每个细胞Comet的头部和整体进行Mask圈选，软件根据圈选结果，自动会生成Comet Head/Total Comet Circularity, Comet Head/Total Comet Size, Comet Head/Total Comet Area等诸多参数，Gen5软件更强大的是，它能够任意调用其中任何的运算结果进行自定义的公式运算，比如% DNA in Comet Tail的计算（图4下方）。

图4，Gen5对Comet Assay进行Mask圈选。

无DNA损伤的样品，由于不存电泳迁移，则Total Comet Circularity和Comet Head Circularity 的比值接近1，使用公式计算出的结果数值非常小，体现出在comet tail中的DNA含量非常小（图5）。

图5，无DNA损伤的样品，Gen5对Total Comet（左图）的Mask圈选和对Comet Tail（右图）的Mask圈选面积、圆度等参数基本一致。

DNA高度损伤的样品， Total Comet Circularity和Comet Head Circularity 的数值差别非常大，因此公式计算结果数值增加，代表comet tail 中的DNA含量增加（图6）。

图6，DNA损伤的样品，Gen5对Total Comet（左图）的Mask圈选和对Comet Tail（右图）的Mask圈选面积、圆度等参数有显著区别。

对于另一个参数Tail Moment（尾距），则需要在% DNA in Comet Tail结果的基础上，针对每个Comet分析更多更细致的图像参数，包括总彗星长度和彗星头部长度，再通过公式运算得出（图7）。

图7，Gen5对Tail moment的计算方法。

别担心这些公式看起来复杂，其实所有的运算步骤都会以程序的方式内嵌在Gen5中，您需要做的只是用艺术家的眼光，轻微调整相关参数，让Gen5的Mask圈选的更加完美。

最后，让我们来对比一下Gen5的软件分析方案和专业的CometAssay图像分析软件Loats（这个软件就做这一件事儿）的数据对比吧，统计结果的柱状图中可以看出，Gen5和Loats对标准CometAssay对照细胞电泳后的两种评价指标的分析结果保持一致（图8），可以说Gen5的解决方案毫不逊色于专业的CometAssay分析软件，更何况，Gen5联合Cytation或Lionheart FX能够提供除了CometAssay之外的更多精彩应用呢！

图8，Gen5和Loats软件对标准CometAssay对照细胞组在% DNA in Comet Tail（慧尾DNA%） 及 Tail Moment（尾距）评价指标的统计结果。

如果您正好在做CometAssay的实验，又正好惆怅于没有合适的成像分析软件，那么我们今天介绍的Cytation或Lionheart FX联合Gen5图像数据分析软件的这个解决方案就能让您展颜一笑啦，不但能够轻松成像高通量的单细胞电泳图像，还能够智能计算Comet Assay中的两项重点参数，可调取的内嵌程序记忆功能有助于您实现自定义分析模块，拓展更多的分析参数及评估方向。

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