DMPK专栏 | 使用LC-MS对反义寡核苷酸 Eluforsen 的代谢物进行分析

2022-04-29 15:34:54 艾杰尔-飞诺美(Agela & Phenomenex)


摘要


Eluforsen(以前称为 QR-010)是一种 33 聚体 20-甲氧基修饰的硫代磷酸酯反义寡核苷酸,靶向囊性纤维化患者 CFTR 蛋白编码基因中的 F508del 突变。在这项研究中,将 eluforsen 与内切核酸酶和外切核酸酶以及小鼠肝脏匀浆一起孵育,以阐明其体外代谢。小鼠和猴子用于确定吸入后 eluforsen 的体内肝和肺代谢。我们开发了一种液相色谱-质谱法,用于鉴定和半定量 eluforsen 代谢物,然后将该方法应用于体外和体内代谢研究。在蛋白酶 K 消化后使用固相萃取进行样品制备。在体外培养系统中的小鼠肝脏中观察到由 3’种核酸外切酶引起的 eluforsen 链缩短的代谢物,以及在来自小鼠和猴子体内研究的肝脏和肺样品中由 3’种核酸外切酶或 5’种核酸外切酶引起的链缩短代谢物。本研究为在体外和体内研究中进一步表征 2’-核糖修饰的硫代磷酸酯寡核苷酸的代谢物提供了方法,以支持寡核苷酸治疗剂的开发。


关键词:Eluforsen、反义寡核苷酸、LC-MS、体外代谢、体内代谢、Clarity、OTX



实验部分(仪器、试剂与材料)

1

主要仪器设备

LC-MS/MS


2

试剂材料

Eluforsen;

DMCHA, DIEA, HFIP甲醇(LC-MS 级),乙腈(LC-MS 级)

RNase A, Proteinase K;

Clarity OTX;


3

样品预处理

蛋白酶K消化缓冲液(60 mM Tris、100 mM EDTA、400 mM 盐酸胍和 0.1% Triton X-100, pH 9)储存在 4°C。使用前将 20 mM DTT 添加到缓冲液的等分试样中。在水中制备 200 mg/mL 的蛋白酶 K 溶液并储存在 20°C。将 20 mL 消化缓冲液和 15 mL 用于体内样品的蛋白酶 K 添加到 100 mL 的每个匀浆样品中。将所有样品涡旋至少 1 分钟,然后在 55°C 下加热,同时摇动 (250 g) 3 小时。然后用 SPE处理样品。


4

样品净化

在蛋白酶 K 消化后,使用 Phenomenex Clarity OTX 小柱(Phenomenex, Torrance, CA, USA)进行 SPE。如前所述,在水中制备平衡缓冲液 (50 mM NH4OAc),并用乙酸将 pH 值调节至 5.5。通过将平衡缓冲液与乙腈以 1:1 的比例混合来制备洗涤缓冲液。通过将 50 mL 溶液(100 mM NH4HCO3 和 1 mM TCEP 在水中,pH 9.5)与 40 mL 乙腈和 10 mL THF 混合制备洗脱缓冲液。使用 1 mL 甲醇和 1 mL 平衡缓冲液对 SPE 小柱进行调节。然后将组织样品与 90 µL 的 Clarity OTX 缓冲液混合并加载到色谱柱上。使用 4 mL 洗涤缓冲液洗涤小柱,并用 0.5 mL*2 洗脱缓冲液洗脱分析物。将收集的溶液在真空下蒸发至接近干燥并用去离子水复溶。


5

LC-MS/MS色谱条件

色谱柱:Clarity 2.6-µm Oligo-XT 100 Å, 2.1*100mm 

流动相A:15 mM DMCHA 和 25 mM HFIP in 5% 甲醇;

流动相B:95%甲醇;

流速:0.5mL/min;

柱温:60 ℃

进样量:15 µL

流动相梯度:见表1

表1 流动相梯度表

时间 (min)

A%

B%

0

100

0

5

100

0

25

65

35

25.01

0

100

30

0

100

30.01

100

0

35

100

0


实验结果

图1 Eluforsen 及其代谢物的代表性提取离子色谱图


表2 Eluforsen 及其潜在代谢物的序列、选择的

电荷状态和 m/z


表3 与纯化的核酸酶和小鼠肝脏匀浆孵育后体外产生的 Eluforsen 代谢物以及小鼠和猴子肝脏和肺样品中体内产生的代谢物


图3 用小鼠肝脏匀浆测定 30 种 Eluforsen 末端短链的形成率


图4 小鼠和猴子体内肝和肺样品中

Eluforsen 代谢物的生成趋势


结论:

开发了一种 LC-MS 方法,用于分析在体外和体内研究中产生的完全硫代磷酸化 20-O-Me 修饰的寡核苷酸及其代谢物。在体外测试系统中使用核酸酶和小鼠肝脏匀浆以及吸入给药后小鼠和猴子的体内肝脏和肺样本评估 eluforsen 的代谢。我们已经证明,具有完全 PS 修饰的基于 RNA 的寡核苷酸和具有 20-O-甲基的完全修饰的核糖提供了更高的稳定性,可抵抗核酸酶的碱基水解。纯化的酶不能消化 eluforsen。与肝匀浆孵育导致从3’端产生 n-1 到 n-8,而从5’端没有形成代谢物。3’和5’末端的链缩短代谢物在两种物种(小鼠和猴子)的体内肝脏和肺中形成,结果表明在这两种物种中产生了相似的代谢物。最终,我们相信这些代谢研究将有助于改进对其他修饰治疗性寡核苷酸代谢物的鉴定,从而推进对这一重要疗法的非临床药物安全性评估。


本文部分摘自:Nucleic Acids Vol. 17 September 2019



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