又是激酶！蛋白质组学发现CDK6是多发性骨髓瘤药物抗性的靶点

免疫调节药物来那度胺(lenalidomide)和泊马度胺(pomalidomide)是治疗多发性骨髓瘤的高效治疗方法。然而，几乎所有的患者最终都由于获得性耐药性而复发，只有在一小部分病例中发现了导致耐药性的基因改变。

为了确定耐药性的非遗传机制，德国的研究团队对多发性骨髓瘤患者治疗前和复发样本进行蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和转录RNA测序，并发现激酶CDK6在复发样本中高表达。随后通过细胞学和动物学上的检测，明确抑制剂/靶向降解CDK6与IMiD具有协同抑制肿瘤的作用，CDK6可作为免疫调节药物（IMiD）耐药多发性骨髓瘤的用药靶点。相关研究成果以“Proteomic profiling reveals CDK6 upregulation as a targetable resistance mechanism for lenalidomide in multiple myeloma”为题，发表在Nature Communications（中科院JCR一区，IF:14.919）上。

1. 蛋白质组学发现在复发组中发生显著变化的蛋白

5对病人治疗前（诊断组）和复发（复发组）的蛋白质组学共检测到6094个蛋白，复发组比诊断组共分析得到显著上调的蛋白130个，显著下调的蛋白228个。前6上调的蛋白为TRIP13、RRM1、NCAPD2、NCAPH、MORF4L1和 CDK6；前6下调的蛋白为UPRT、DNAJC1、FCRL2、AUH、HYI和HID1。作者在另一批样本（4个首次诊断+9个复发）中对其中的几个上调蛋白进行了WB验证，结果表明CDK6、TRIP13和RRM1在复发组中能更多地被检测到。

2. RNA测序、磷酸化蛋白质组和蛋白质组的比较

复发组比诊断组的RNA测序分析到了较少的差异基因。作者将蛋白质组学和RNA测序结果进行比较，发现转录组和蛋白组的相关性较差，皮尔森相关性系数（PCC）较差仅为0.34。在上调最高的蛋白中，有丝分裂调节蛋白TRIP13的RNA和蛋白表达的相关性最高(PCC=0.84)，其次是NCAPH（PCC=0.84）和NCAPD2（PCC=0.67）。RRM1和CDK6的RNA与蛋白的相关性分别为0.6和0.39。

磷酸化蛋白质组共检测到5698个蛋白上的24796个磷酸化肽段。发生显著变化的磷酸化肽段，其所属蛋白大部分均在蛋白质组学中被检测到，但仅有15个位点其对应的蛋白发生了表达变化，即大多数磷酸化水平发生变化的位点其蛋白表达水平未发生变化。

3. CDK6、TRIP13和RRM1的蛋白表达与CRBN无关

由于突变、缺失或下调导致的CRBN-CRL4 E3连接酶功能障碍会改变多种多发性骨髓瘤细胞系和患者对免疫调节药物（IMiD）的敏感性，因此作者分析了CRBN的表达。在RNA测序和蛋白质组学结果中均未观察到复发组比治疗组的改变。在4对样本的全外显子测序中也未发现CRBN-CRL4 E3连接酶上的突变，在另一批样本中也未检测到CRBN的表达变化。同样，CRISPR/cas9介导的骨髓瘤细胞系中CRBN的敲除并没有改变CDK6、TRIP13和RRM1蛋白的表达水平。此外，在患者样本中也未观察到基因改变与CDK6、TRIP13或RRM1蛋白表达之间的关联，即CDK6、TRIP13和RRM1的蛋白表达与CRBN无关。

4. CDK6蛋白在来那度胺抗性多发性骨髓瘤细胞中表达上调

作者使用不同浓度的来那度胺(lenalidomide)培养多发性骨髓瘤细胞系MM.1S和LP-1。100nM 来那度胺(lenalidomide)培养数周的细胞对来那度胺(lenalidomide)产生抗性，且存在CDK6蛋白水平的升高。这与来那度胺(lenalidomide)治疗的骨髓瘤患者的研究结果高度一致。相比之下，来那度胺(lenalidomide)或蛋白酶体抑制剂短期治疗72h后，CDK6没有升高，甚至发生了降低，该结果表明CDK6的表达不是由药物直接诱导的。

5. 过表达CDK6会降低多发骨髓瘤对免疫调节药物（IMiD）的敏感性

作者进一步验证了CDK6、TRIP13和RPM1与药物抵抗的因果关系。过表达CDK6和RPM1显著降低多发性骨髓瘤细胞对来那度胺(lenalidomide)的敏感性。同时作者发现，当过表达酶活丧失的CDK6（K34M）时，骨髓瘤细胞对来那度胺(lenalidomide)的敏感性并不会降低，这表明CDK6的作用依赖于它的激酶活性。最后，作者发现过表达TRIP13不改变多发性骨髓瘤细胞对来那度胺(lenalidomide)的抗性。

6. 抑制CDK6使多发性骨髓瘤细胞对免疫调节药物敏感

鉴于CDK6在来那度胺(lenalidomide)耐药患者中表达上调，而诱导表达降低了骨髓瘤细胞对来那度胺的敏感性，作者接下来检测了CDK6抑制剂帕博西尼（Palbociclib）在多发性骨髓瘤细胞系中的作用。帕博西尼对多发性骨髓瘤细胞的抑制只有无或者中等的作用。然而，帕博西尼和免疫调节药物（IMiD）泊马度胺(pomalidomide)联合使用具有高度协同作用，帕博西尼能显著增强了泊马度胺的抗多发性骨髓瘤作用。作者在所有表达不同水平CDK6的细胞系中都观察到了这种效应。此外，在CDK6蛋白水平升高的获得性来那度胺耐药细胞以及过表达CDK6的骨髓瘤细胞中，帕博西尼处理后均使得细胞对于免疫调节药物（IMiD）的敏感性恢复到与原细胞相似的水平。这些数据表明，帕博西尼治疗增加了多发性骨髓瘤细胞对免疫调节药物（IMiD）泊马度胺的敏感性。

7. 降解CDK6和IKZF1/3的双功能PROTACs具有分子内协同作用

接下来，作者使用蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)技术在细胞中特异性降解CDK6或/和KEF1/3后骨髓瘤细胞的生长和增殖情况。与帕博西尼的结果一致，PROTAC介导的CDK6降解降低了一部分细胞系中多发性骨髓瘤细胞的生长。VHL型PROTAC CST528与IMiDs具有协同效应，这与使用CDK6激酶抑制剂帕博西尼观察到的结果一致。相比之下，IMiDs与CRBN型靶向CDK6的PROTAC(BSJ-03-123)的结合显示出拮抗作用，这可能是由于对CRBN E3连接酶的竞争。

作者继续检测了一种基于泊马度胺(pomalidomide)的CRBN型PROTAC，YKL-06-102，该PROTAC保留了泊马度胺的活性，并能有效地诱导CDK6和IMiD新底物IKZF1和IKZF3的降解。YKL-06-102显著降低了所有10种多发性骨髓瘤细胞系的活力，包括那些IMiD敏感性较低的细胞系。这些结果表明，同时靶向CDK6、IKZF1和IKZF3的CRBN型PROTACs通过分子内协同作用在多发性骨髓瘤细胞中可有效地抑制癌细胞生长。

知识点：PROTAC 是一种杂合双功能小分子化合物，其结构由两个配体组成，一个是泛素连接酶配体，另一个是与细胞中目标靶蛋白结合的配体，两个配体之间通过 Linker 相连，形成靶蛋白配体-Linker-E3 配体的聚合物。随后，E3 连接酶给靶蛋白加上泛素化标签，启动细胞内强大的泛素化水解过程，通过泛素-蛋白酶体途径特异性地降解靶蛋白。von Hippel-Lindau (VHL) 型和 Cereblon (CRBN) 型 E3 泛素连接酶复合体是当前两种在PROTAC中应用火热的类型。

8.  泊马度胺和帕博西尼联合治疗的体内效果显著

为了检测IMiDs与CDK6抑制剂的联合使用在体内是否有治疗效果，作者构建了MM.1S细胞的小鼠移植瘤模型，并在成瘤后将小鼠随机分组进行17天的治疗。与单独接受泊马度胺或帕博西尼的小鼠相比，联合治疗组对肿瘤生长的有效抑制能显著改善小鼠的生存。且停止治疗后，肿瘤生长恢复，这表明两种药物的延长治疗对防止多发性骨髓瘤复发是必要的。

9. IMiDs和CDK6抑制剂协同作用不依赖于RB1蛋白

因为RB1蛋白是CDK6的底物，因此作者检测了CRIPSR/Cas9介导的RB1敲除后，多发骨髓瘤细胞对于药物泊马度胺和CDK6抑制剂帕博西尼单用或联用的敏感性。结果表明，RB1敲除可以影响骨髓瘤细胞对帕博西尼（Palbociclib）的敏感性，但不会影响细胞对泊马度胺和帕博西尼联用的敏感性，多发性骨髓瘤细胞对IMiDs的敏感性不依赖于RB1。

10. CDK6抑制反转了复发相关的蛋白特征

作者检测了泊马度胺、帕博西尼和特异性降解CDK6单用或联用的多发性骨髓瘤细胞系MM.1S的蛋白组学和磷酸化蛋白质组学特征。蛋白质组学共检测到7460个蛋白，其中分别有240个和179个蛋白在泊马度胺或帕博西尼单用的骨髓瘤细胞中差异表达。而帕博西尼单用的蛋白质组学和特异性降解CDK6的骨髓瘤细胞的蛋白组学高度相关。此外，作者注意到一个很明显的蛋白变化模式：在复发患者样本中上调的蛋白在CDK6抑制或降解后的MM.1S细胞中下调表达（共17个蛋白）。同样的，在复发患者样本中下调的蛋白在CDK6抑制或降解后的MM.1S细胞中上调表达（共37个蛋白）。

11. 磷酸化蛋白质组学鉴定CDK6的底物

作者分析了CDK6抑制剂帕博西尼处理和CDK6特异性靶向降解的MM.1S细胞的磷酸化蛋白质组学结果，以寻找CDK6的底物。共鉴定出2811个磷酸化肽段，其中96个蛋白上的122个磷酸肽在帕博西尼或靶向降解处理3 h后显著下调。此外，在帕博西尼处理24 h后，558个不受整体蛋白水平调控的蛋白的磷酸化状态被特异性下调(1022个磷酸化肽段)，其中45个蛋白与3 h时间点的结果重叠，即这些磷酸化位点从早期时间开始持续下调。鉴定到的磷酸化位点包括已知的CDK4/6底物RB1、RBL1、RBL2和CDKN1A，以及在复发样本中调节的一些蛋白(DNTM1、GMPS、KLHDC4、NCAPD2、NCAPH、GLYR1、NOP56)。该结果提供了CDK6激酶功能和CDK6调节蛋白水平之间的功能联系。

研究者对5对来自多发性骨髓瘤患者的治疗前和复发样本进行了蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学分析和RNA测序。这些分析揭示了CDK6在复发样本中的高表达。在多发性骨髓瘤细胞系中过表达CDK6降低了对IMiDs的敏感性，而通过CDK6抑制剂或蛋白水解(PROTACs)降解CDK6与IMiD具有高度的协同作用。此外，研究者还对CDK6抑制剂帕博西尼（Palbociclib）处理和CDK6特异性靶向降解的骨髓瘤细胞的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学检测，并发现CDK6抑制反转了复发相关的蛋白特征且分析得到了一些CDK6的底物。总体，本研究找到了多发性骨髓瘤的一个非基因变异的靶点——CDK6，该激酶可作为IMiD耐药的多发性骨髓瘤的用药靶点，具有潜在的临床应用价值。