如何给核酸定量检测“减负”？(内附操作视频）

虽然已有多种有效、灵敏的检测方法，但是针对大批量的样本进行快速的 DNA 定量检测均经常利用紫外光吸收法，也是目前最常使用的方法。核酸浓度在 260nm 处测量样品，并在 230nm 和 280nm 波长处进行辅助测量，以检查样品纯度。其原理是利用分子在固定波长范围吸收光和散射光，借助在朗伯比尔定律 ( 方程式 1 ) 的基础上计算，朗伯比尔定律是指吸光度 ( A ) 等于分子摩尔消光系数 ( ε ) 乘以浓度 ( c ) 和通路长度 ( L )。

优势在于简便、快速、无需试剂等，缺点是单链 DNA 和 RNA 会对检测结果产生干扰，且样品中的杂质（如盐离子和蛋白质）也会影响检测的结果，这种检测方法的灵敏度也相对较低（用 1cm 的比色杯在 A260 值为 0.1 时相对应的双链 DNA 浓度为 5μg/ml ），正是由于此方法检测灵敏度低，限制了其在某些检测领域中的使用。

然而在许多实验中，由于制备的方法或者样本不足，可能需要对非常少量的样本进行定量检测。如小提质粒、提基因组 DNA ，或是酶切片断电泳胶回收得到的以微升计算体积的核酸样品，如果使用比色皿或者微孔板为其检测容器的话，无法满足检测条件。这时就需要一种微量、快速、灵敏、简便的检测手段能对 DNA 进行定量检测。

针对市场上的需求，Molecular Devices 公司推了一种特殊可重复使用的超微量检测板（如下图 1 所示），是专门针对微量 DNA 、RNA 、蛋白质（最低仅需要 2ul 样品）就可以检测的一套工具。它可以配合 Molecular Devices 公司推出的所有具有光吸收功能的酶标仪（波长范围最低能达到 200nm ）使用。如 SpectraMax ABS Plus\\SpectraMax i3x 等，由于微量检测板为石英材质，可以最大的减少紫外光对检测结果的干扰，提高检测灵敏度（达到 2ng/ul ），有 24 孔和 64 孔两种不同规格的微量检测板，并且是目前市面上通量最高的微量检测板。其孔位置完全符合标准排枪尺寸，通过软件内置模板（如图 2 所示），加样品后直接放入酶标仪中调出检测模板，能在几秒内得到全部样品 DNA 浓度值。

为了验证超微量检测板在光吸收检测准确度和重复性，我们利用 1000ng/μL 的超纯小牛胸腺双链 DNA，用 1xPBS 倍比稀释。将 2 或 4μL 样品加入 64 孔 SpectraDrop 微量板中，并用 0.5mm 或 1.0mm 盖玻片盖住样品。数据结果用双对数曲线进行表示，SoftMax Pro 软件会进一步生成标准曲线。(如图 3 所示)。另外，软件内置光谱扫描功能，通过范围为 220nm 至 350nm，步进为 4mm 的光谱扫描可以检测样品纯度。（如图 4 所示）

图 3 ：利用 SpectraDrop 超微量板进行 dsDNA 的定量 ABS Plus 读板机配置 SpectraDrop 微孔板后，对 DNA 的检测灵敏度可以降至 2ng/μL 和 4ng/μL，图中所示为检测 DNA 的浓度曲线，其中蓝色为 1mm 盖玻片，红色为 0.5mm 盖玻片

某些荧光染料分子（如 PicoGreen、Hoechst、QuantiFluor 等）能与双链 DNA 分子发生特异性结合，在一定 DNA 浓度范围内以及该荧光染料过量的情况下，荧光强度与 DNA 浓度成正比，通过带有荧光功能的酶标仪（如 Molecular Devices 公司的 SpectraMax EM 、SpectraMax XPS、或者是全新卡盒式多功能酶标仪 SpectraMax i3x ），可以检测出其样品中双链 DNA 含量。

而其中的 PicoGreen 荧光染料分子的检测方法已被 2010 年版《中华人民共和国药典》收录为药物残留 DNA 定量检测标准方法之一，广泛的应用于重组类生物制品（药典规定 DNA 残留量不高于 10ng ）中。荧光定量分析对低浓度的少量样本有更高的敏感度。SpectraDrop 微孔板包含一个特别设计的适配器和光学透明度可以应用在光吸收和荧光两种模式下的石英材质的玻片组合，以满足实验的需求。荧光方法使用超微量检测板，其检测灵敏度能达到 2.5pg/ul ，是普通光吸收法检测灵敏度的 1000 倍。如图 5 所示；

图5 ：使用 SpectraMax Paradigm  仪器及超微量检测板荧光方法，PicoGreen 荧光探针对 dsDNA 标记后，最低检测下限为 2.5pg/ul ，标准曲线 R^2 为 0.999

无论是光吸收或荧光检测方法，均可在 Molecular Devices 公司的读板机（酶标仪）上配合 SpectraDrop 石英材质超微量实现检测，2ul 或 4ul 的微量样品进行检测，可支持最多同时 64 个样品通量的检测，使用方便快捷、通量高。且仪器自带的数据采集和分析软件 SoftMax Pro 里已包含有针对不同实验方法的预设检测模板，只需调用模板并读数即可获得核酸相关定量结果，简化流程、提高效率。

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