四大药典溶液颜色检查规范/同与异-大盘点

2022-04-19 06:04:49, 胤煌科技上海胤煌科技有限公司

引言

溶液颜色检查是药物的物理特性检查的常规检查项，关于溶液颜色检查法，各国药典均有进行描述，其中有一些相同的地方，但是也存在一些差异。下面就通过对比中国药典、美国药典、欧洲药典及日本药典中的溶液颜色检查法，对各国的溶液颜色检查规范进行梳理，方便大家引用参考。

检查方法

关于溶液颜色检查，中国药典和美国药典均给出了三种方法，欧洲药典和日本药典只有目视法。详见下表。

药典	检查方法	参考章节
中国药典	方法1：目视法方法2：紫外-可见分光光度法 <通则0401> 方法3：色差计法	中国药典2020： 0901溶液颜色检查法
美国药典	方法1：目视比色法方法2：分光光度法<857> 方法3：比色法	USP40： <630> VISUAL COMPARISON <631> COLOR AND ACHROMICITY COLORIMETRIC SOLUTIONS (CS) <1601>COLOR—INSTRUMENTAL MEASUREMENT
欧洲药典	目视法	EP10.0： 2.2.2. DEGREE OF COLORATION OF LIQUIDS
日本药典	目视法	JP 17： 2.65 Methods for Color Matching

在上述的溶液颜色检查方法中，目视法依赖于人眼的主观观察，而分光光度法、色差计法及美国药典中的比色法（色差计法）则是属于仪器测量的范畴。

四大药典中都将目视法作为溶液颜色检查的方法，首先我们来归纳一下四大药典中目视法的相似与区别：

比色液颜色体系

药典	原始溶液	比色液的色调—色号	评判“无色”
中国药典	重铬酸钾溶液硫酸铜溶液氯化钴溶液	绿黄色/黄绿色/黄色/橙黄色/橙红色/棕红色—0.5/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10号 [每个色调配置11个色号]	颜色与水或所用溶剂相同，则判定为“无色”，颜色不深于色调0.5号标准比色液判定为“几乎无色”
美国药典	氯化钴溶液硫酸铜溶液三氯化铁溶液	色号A-T [一共20个色号]	无说明
欧洲药典	三氯化铁溶液氯化钴溶液硫酸铜溶液	B/BY/Y/GY/R（棕/棕黄/黄/黄绿/红）—B₁-B₉/BY₁-BY₇/Y₁-Y₇/GY₁-GY₇/R₁-R₇ [一共37个色号]	如果溶液的外观为水，颜色不比参考溶液B₉强烈，则溶液被定义为无色
日本药典	氯化钴溶液硫酸铜溶液三氯化铁溶液	系列1；色号A-T [一共20个色号] 系列2：B/BY/Y/GY/R（棕/棕黄/黄/黄绿/红）—B1-B9/BY1-BY7/Y1-Y7/GY1-GY7/R1-R7 [一共37个色号]	如果溶液的外观为水，颜色不比参考溶液B9强烈，则溶液被定义为无色

从以上各国药典的比色液的原始溶液的配置情况来看，四国药典中均选择了硫酸铜溶液作为蓝色原始溶液、氯化钴溶液作为红色原始溶液。四国药典在黄色原始溶液选择的化学试剂有区别，中国药典选用了重铬酸钾溶液，而美国/欧洲/日本药典均选用三氯化铁溶液作为黄色原始溶液。

而用作参考用的比色液，中国药典中涉及到的比色液的色号是最多的（共66个），日本药典则综合了欧洲药典和美国药典中的比色液配置方式以及命名方式。

测试方法

药典		所需装置		取样量	检查方法
中国药典		25 mL那氏比色管		10 mL	两管同置于白色背景上，自上向下观察；或同置于白色背景前，平视观察，供试品管呈现的颜色与对照管比较，不得更深
美国药典		应使用内径、样品溶液深度和所有其他方面尽可能匹配的颜色对比管。		供试品溶液与对照比色液的体积一致	管子应该在白色光背景下向下观察。如果需要，且实验条件一致，可使用从管底部下方引导的光源
欧洲药典	方法1：	外径为12 mm的无色透明中性玻璃管		2.0 mL	比较溶液在漫射日光下的颜色，在白色背景下水平观察
	方法2：	无色透明中性玻璃管，底部平坦，内径为 15 mm至25 mm		溶液的深度为40 mm	比较溶液在漫射日光下的颜色，在白色背景下垂直观察
日本药典	使用系列1比色液	那氏比色管		供试品溶液与对照比色液的体积一致	白色背景下横向观察
	使用系列2比色液	方法1：	外径为12 mm的透明和无色玻璃试管	2.0 mL	在白色背景的散射光下横向观察
		方法2	内径为15-25 mm的透明无色平底试管	溶液深度为40 mm	在白色背景的散射光下垂直观察

在上表格中已经给出了四国药典中的目视法检查溶液颜色的实验操作方法，但在对于评判结果的注意事项，中国药典和美国药典也给出了一些声明。

《中国药典0901溶液颜色检查法》章节中指出：如供试品管呈现的颜色与对照管的颜色深浅非常接近或色调不完全一致，使目视观察无法辨别两者的深浅时，应改用第三法（色差计法）测定，并将其测定结果作为判定依据。

美国药典<631>COLOR AND ACHROMICITY章节中指出：Liquids should be compared in matched color-comparison tubes, against a white background. If results are found to vary with illumination, those obtained in natural or artificial daylight are to be considered correct. Instead of visual determination, a suitable instrumental method may be used. （液体应在对应的比色管中与白色背景进行比较。如果发现结果随照明而变化，则此处认为在自然光或人工日光下获得的结果是正确的。此时可以使用合适的仪器方法代替目视法进行测定）。即当一定条件下的测试结果存在争议时，应使用仪器法对溶液颜色进行测定。

介绍完四国药典中溶液颜色检查法中目视法的区别，接下来我们对中国药典和美国药典当中溶液颜色检查的仪器法进行分析。在目视法观察溶液颜色差异的过程中，人的主观因素对决定判定结果起到了很大的作用，而仪器法则能提供更多的客观数据，以弥补人眼观察的不足。

分光光度法

紫外-可见分光光度法的测试原理为：当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。

药典	中国药典	美国药典
操作方法	除另有规定外，取各供试品项下规定量的供试品，加水溶解并使成l0 ml, 必要时滤过，滤液照紫外-可见分光光度法通 (则0401)于规定波长处测定，吸光度不得超过规定值。	在紫外-可见光谱法<857>下讨论的注意事项也适用于仪器颜色测量。在分光光度法中，在整个可见光谱（380 nm-770 nm）的离散波长处获得反射率或透射率值，使用10 nm或更小的带宽进行检测，以计算三刺激值。

色差计法

色差计法的工作原理简单地说即是模拟人眼的视觉系统，利用仪器内部的模拟积光学系统，把光谱光度数据的三刺激值X、Y、Z进行积分而得到颜色的数学表达式，从而计算出 L*（明度指数）、a*（色品指数）、b*（色品指数）值及对比色的色差ΔE*。

药典	中国药典	美国药典
校准方法	在每次测量时，按仪器要求，需用水对仪器进行校准，并规定水在D65为光源，10°视场条件下，水的三刺激值分别为：X=94.81；Y=100.00；Z=107.32	对于透射率测量，可将纯化水用作白色标准，并指定所有波长的透射率为1.000。然后CIE光源C下的三刺激值X、Y和Z分别为98.0、100.0和118.1。
测量方法	使用具备透射测量功能的测色色差计进行颜色测定，照明观察条件为0/0(垂直照明 /垂直接收）条件；D65 光源照明，10°视场条件下，可直接测出三刺激值 X、Y、Z，并能直接计算给出L、a、b和 △E。因溶液的颜色随着被测定的溶液液层厚度而变，所以除另有规定外，测量透射色时，应使用1cm厚度的液槽。	对于透明液体光谱透射率的测量，试样从法线的5°范围内照射到其表面，测量的透射能限制在法线的5°范围内。溶液的颜色随测量层的厚度而变化。除非特殊考虑另有规定，否则应使用1 cm厚的层。
结果判定	除另有规定外，用水对仪器进行校准，取按各品种项下规定的方法分别制得的供试品溶液和标准比色液，置仪器上进行测定，供试品溶液与水的色差值△E应不超过标准比色液与水的色差值△E 。如品种正文项下规定的色调有两种，且供试品溶液的实际色调介于两种规定色调之间，难以判断更倾向何种色调时，将测得的供试品溶液与水的色差值)与两种色调标准比色液与水的色差值的平均值比较，不得更深[△E≤(△E^s₁+△E^*s₂)/2]。	工具变量可以影响结果。虽然可以在同时测量的类似颜色之间进行可靠的比较，但在不同仪器或不同操作条件下获得的结果应谨慎进行比较。如果有必要比较从不同仪器获得的数据或在不同时间获取的数据，对比参考材料上的读数有助于识别仪器性能引起的变化。
备注	由于浑浊液体、黏性液体或带荧光的液体会影响透射，故不适宜采用色差计法测定。	此法不适用于朦胧液体。

结论

经过对中国药典、美国药典、欧洲药典以及日本药典中的溶液颜色检查规范的梳理，我们可以看到：

1、目视法是这四国药典中普遍记载的检查方法，说明这种方法的使用具有普遍性。

2、在中国药典和美国药典中也明确指出：当溶液颜色很相近，目视法难以区分或辨别时，应采用色差计法（仪器法）进行检测，以获得更加准确的测试结果，表明使用仪器测量溶液颜色可能是一个发展趋势。

3、可以注意到如果样品溶液浑浊、粘度大或者带有荧光效应时，会影响到样品的透射测量，此时不适宜于用色差计法进行检测，所以在进行溶液颜色检查的时候，我们应选取合适的方法将进行检测。

另外，由于这四国药典中的溶液颜色检查的参考标准不一样，所以不建议随便套用。现在大家是否对中国药典、美国药典、欧洲药典以及日本药典中的溶液颜色检查规范的异同之处有了明确的把握呢？如有不当之处，敬请指正。

附：四大药典中的比色液配置方法

中国药典2020

比色用重铬酸钾液 精密称取在120 °C 干燥至恒重的基准重铬酸钾0.4000 g，置500 ml量瓶中，加适量水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。每l ml溶液中含0.800 mg的K2Cr2O7。

比色用硫酸铜液 取硫酸铜约32.5 g，加适量的盐酸溶液(1-40)使溶解成500 ml，精密量取10 ml，置碘量瓶中，加水50 ml、醋酸 4 ml与碘化钾2 g，用硫代硫酸钠滴定液(0.l mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液2 ml，继续滴定至蓝色消失。每 l ml硫代硫酸钠滴定液(0.l mol/L)相当于24.97 mg的CuS04·5H2O。根据上述测定结果，在剩余的原溶液中加适量的盐酸溶液(1-40)，使每l ml溶液中含62.4 mg 的 CuS04·5H2O，即得。
比色用氯化钴液 取氯化钴约32.5 g，加适量的盐酸溶液(1-40)使溶解成500 ml，精密量取2 ml，置锥形瓶中，加水200 ml，摇匀，加氨试液至溶液由浅红色转变至绿色后，加醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 6.0)10 ml，加热至60 °C，再加二甲酚橙指示液5滴，用乙二胺四醋酸二钠滴定液 (0.05 mol/L)滴定至溶液显黄色。每 l ml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)相当于11.90 mg 的 CoCl2·6H2O。根据上述测定结果，在剩余的原溶液中加适量的盐酸溶液（1-40)，使每l ml溶液中含59.5 mg的CoCl2·6H2O，即得。

各种色调标准贮备液的制备按表 1 精密量取比色用氯化钴液、比色用重铬酸钾液、比色用硫酸铜液与水，混合摇匀，即得。

各种色调色号标准比色液的制备按表2精密量取各色调标准贮备液与水，混合摇匀，即得。

美国药典USP40

氯化钴比色溶液：将约65 g六水合氯化钴（CoCl2·6H2O）溶解在25 mL盐酸和975 mL水的混合液中，制成1000 mL溶液。用移液管将5 mL该溶液移入250 mL碘瓶中，加入5 mL过氧化氢和15 mL氢氧化钠溶液（1/5），煮沸10分钟，冷却，并加入2 g碘化钾和20 mL稀硫酸（1/4）。沉淀溶解后，用0.1 N硫代硫酸钠溶液滴定释放的碘，加入3 mL淀粉试液作为指示剂。使用相同量的相同试剂进行空白组的测定，并进行必要的校正。每毫升0.1 N硫代硫酸钠溶液相当于23.79 mg CoCl2·6H2O。通过添加足够多的盐酸和水的混合物来调整溶液的最终体积，使每毫升溶液含有59.5 mg CoCl2·6H2O。

硫酸铜比色液：将约65 g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解在25 mL盐酸和975 mL水的足够混合物中，制成1000 mL溶液。用移液管将10 mL该溶液移到250 mL碘瓶中，加入40 mL水、4 mL醋酸、3 g碘化钾和5 mL盐酸，并用0.1 N硫代硫酸钠溶液滴定释放的碘，添加3 mL淀粉试液作为指示剂。使用相同数量的相同试剂进行空白测定，并进行必要的校正。每毫升0.1 N硫代硫酸钠溶液相当于24.97 mg CuSO4·5H2O。通过添加足够的盐酸和水的混合物来调整溶液的最终体积，使每毫升溶液含有62.4 mg CuSO4·5H2O。

三氯化铁比色液：将约55 g三氯化铁（FeCl3·6H2O）溶解在25 mL盐酸和975 mL水的足够混合物中，制成1000 mL。用移液管将10 mL该溶液移到250 mL碘瓶中，添加15 mL水、3 g碘化钾和5 mL盐酸，并使混合物静置15分钟。用100 mL水稀释，用0.1 N硫代硫酸钠溶液滴定释放的碘，加入3 mL淀粉作为指示剂。使用相同数量的相同试剂进行空白测定，并进行必要的校正。每毫升0.1 N硫代硫酸钠溶液相当于27.03 mg FeCl3·6H2O。通过添加足够的盐酸和水的混合物来调整溶液的最终体积，使每毫升含有45.0 mg FeCl3·6H2O。

可根据附表制备字母标识的流体颜色匹配标准。为制备所需的匹配液体，用移液管将规定体积的比色试验溶液[参见“试剂、指示剂和溶液”一节中的“比色溶液（CS）”和水移入其中一个匹配容器中，并在容器中混合溶液。在前面描述的观察条件下，按照各专题中的指示进行比较。匹配液体或比色溶液的其他组合可在非常低的浓度下使用，以测量色度偏差。

欧洲药典10.0

黄色初级溶液。在约900 mL的盐酸和975 mL的水中加入4.6 g六水合三氯化铁，并用相同的混合物稀释至1000.0 mL。通过添加相同的酸性混合物，滴定并调整溶液，使其每毫升含有45.0 mg FeCl3·6H2O。溶液避免光照。

滴定。将10.0 mL溶液、15 mL水、5 mL盐酸和4 g碘化钾放入装有磨砂玻璃塞的250 mL锥形烧瓶中，关闭烧瓶，让其在黑暗中静置15分钟，并添加100 mL水。用0.1 M硫代硫酸钠溶液滴定释放的碘。5 mL淀粉溶液，在滴定结束时加入，作为指示剂。

1 mL 的0.1 M硫代硫酸钠溶液相当于27.03 mg六水合三氯化铁FeCl3·6H2O。

红色初级溶液。将60 g二水合氯化钴溶解在约900 mL的25 mL盐酸和975 mL水的混合物中，并用相同的混合物稀释至1000.0 mL。通过添加相同的酸性混合物，滴定并调整溶液，使其每毫升含有59.5 mg CoCl2·6H2O。

滴定。将5.0 mL溶液、5 mL稀释过氧化氢溶液和10 mL 300 g/L氢氧化钠溶液放入装有圆形玻璃塞的250 mL锥形烧瓶中。轻轻煮沸10 min，冷却后加入60 mL稀硫酸和2 g碘化钾。关闭烧瓶，用0.1 M硫代硫酸钠溶液轻轻摇动，溶解沉淀物，使用淀粉溶液，在滴定结束时添加，作为指示剂。当溶液变成粉红色时，即达到终点。

蓝色初级溶液。将63 g五水硫酸铜溶解在约900 mL的25 mL盐酸和975 mL水的混合物中，并用相同的混合物稀释至1000.0 mL。通过添加相同的酸性混合物，滴定并调整溶液，使其每毫升含有62.4 mg CuSO4·5H2O。

滴定。将10.0 mL溶液、50 mL水、1.2 mL稀醋酸和3g碘化钾放入装有磨砂玻璃塞的250 mL锥形烧瓶中。用0.1 M硫代硫酸钠溶液滴定释放的碘，使用0.5 mL淀粉溶液，在滴定结束时添加，作为指示剂。当溶液呈现轻微的淡棕色时，即达到终点。

1 mL的0.1 M硫代硫酸钠溶液相当于24.97 mg五水合硫酸铜CuSO4·5H2O。

使用3种初始溶液制备5种标准溶液，如下所示（表2.2.2.-1）：

方法1和2的参考溶液：

日本药典17

氯化钴（II）CS：将65 g六水合氯化钴溶解在25 mL盐酸和水中，制成1000 mL。用移液管移取10 mL该溶液，加水精确至250 mL。用移液管移取25 mL溶液，加入75 mL水和50 mg多氯化钠指示剂，然后滴加稀释氨溶液（1/10），直到溶液颜色从红紫色变为橙黄色。在接近终点处添加0.2 mL稀释氨溶液（1/10）后，用0.01 mol/L乙二胺四乙酸二钠滴定，直到溶液颜色从黄色变为红紫色。

每毫升0.01 mol/L二氢乙二胺四乙酸二钠相当于2.379 mg六水合氯化钴 CoCl2·6H2O。

根据滴定值，加入稀盐酸（1/40），制成每毫升含有59.5 mg六水合氯化钴（II）的溶液，并使用。将溶液储存在玻璃塞瓶中。

硫酸铜（II）CS：将65 g五水合硫酸铜（II）溶解于25 mL盐酸和水中，制成1000 mL。移液管取10 mL该溶液，加水至250 mL。移液管取25 mL该溶液，加入75 mL水，10 mL氯化铵溶液（3:50），2 mL稀释氨溶液（1/10）和50 mg多氯化钠化指示剂。用0.01 mol/L二氢乙二胺四乙酸二钠滴定，直到溶液颜色从绿色变为紫色。

每1 mL的0.01 mol/L的二氢乙二胺四乙酸二钠相当于2.497 mg的五水合硫酸铜CuSO4·5H2O。

根据滴定值，加入稀盐酸（1/40），制成每毫升含有62.4 mg五水硫酸铜（II）的溶液，并使用。将溶液储存在玻璃塞瓶中

氯化铁（III）CS：将55 g六水合三氯化铁溶解在25 mL盐酸和水中，制成1000 mL溶液。用移液管将10 mL该溶液移到碘瓶中，加入15 mL水和3 g碘化钾，塞紧瓶塞，在黑暗处静置15分钟。向混合物中加入100 mL水，并用0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液（相当于1 mL淀粉指示剂）滴定游离的碘。

每毫升0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液相当于27.03 mg六水合三氯化铁 FeCl3·6H2O。

根据滴定值，加入稀释的盐酸（1/40），制成每毫升含有45.0 mg六水合三氯化铁（III）的溶液，并使用。将溶液储存在玻璃塞瓶中。

根据表2.65-1的指示，使用滴定管或刻度小于0.1 mL的移液管精确测量三种比色储备溶液和水的体积，并混合，制备颜色A至T的比色液。将溶液储存在具塞玻璃瓶中。