【数据会说话】No.2 | 你试过把柱子加热到80℃吗？我帮你试了......

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数据会说话 No.2   每周五17:00准时更新

上节课我们用几款基材、官能团都不同的色谱柱，对蛋白质的溶出行为进行了比较实验，证明了Proteonavi S5在蛋白质分析领域的优势。

【数据会说话】第二期，这节课YoYo老师将对溶出度、柱温和耐久性的关系进行深挖，我们这就开始吧~

Proteonavi S5的溶出行为2 & 3

— 与他社色谱柱的比较 —

ProteonaviS5是一款以孔径为30 nm的硅胶作为基材、键合C4基团的蛋白质・肽类化合物分析色谱柱。

这次，我们以5种肽类化合物（缓激肽、后叶催产素、血管紧缩素II、神经降压素及血管紧缩素I）作为样品，将Proteonavi S5与一款填料表面带有正电荷的他社杂化型色谱柱（孔径13 nm、粒径3.5 μm）的溶出行为进行比较，所得结果见图1。

缓激肽  Bradykinin  (M.W. 1060.2)

后叶催产素  Oxytocin  (M.W. 1007.2)

血管紧缩素ll  Angiotensin II  (M.W.1046.2)

神经降压素  Neurotensin  (M.W. 1672.9)

血管紧缩素l  Angiotensin l  (M.W. 1296.5)

图1 两款色谱柱分析所得色谱图

【色谱条件】

色谱柱: 2.0 or 2.1 mm i.d. x 150 mm

流动相: A)0.1 vol% HCOOH, H2O 

B)0.1 vol% HCOOH, CH3CN

B 15%(0min)30 %(20 min) Gradient

流   速: 0.2 mLmin

温   度: 40°C

检   测: UV 220 nm

进样量: 1 uL

样   品 : H2O (100 ug/mL each)

其中，流动相条件为添加0.1 vol%甲酸的水-乙腈系统，在梯度条件下进行分析，对这两款色谱柱进行了溶出行为的考察。

如图1，他社色谱柱对5种肽类化合物的整体保留较弱，且缓激肽峰未能得到确认（被吸附而未能溶出）；与此相对，Proteonavi S5对这5种肽类化合物均得到了良好的色谱峰形及充分的保留与分离。

— 柱温与溶出行为 —

对肽类化合物进行分析时，有提高柱温的做法。例如，《第17改正日本药局方》中，环孢菌素是在柱温80 ℃附近的温度下进行分析的。

我们以环孢菌素A作为原料，在等度条件下对色谱柱柱温变化及相应的溶出行为进行了考察。图2为所得结果。

环孢菌素A (M.W. 1202.6)

Cyclosporin A

图2 柱温与环孢菌素A溶出行为的关系

【色谱条件】

色谱柱：2.0 mm i.d. x 150 mm

流动相：0.1 vol% HCOOH, HO / CH2CN = 45/55

流   速：0.2 mL/min

温   度：40, 50, 60, 70 or 80℃

检   测：UV 210 nm

进样量：1 μL

样   品：H2O / CH3CN = 50 /50 (100 ug/mL)

如图2，随着柱温的上升，环孢菌素A的保留逐渐减弱，峰形也愈发尖锐。

一般情况下，与小分子相比大分子的扩散速度较慢，因此色谱峰形有展宽的趋势，而设定较高的柱温可以使峰形变得尖锐。

就像这样，常规情况下，在对肽类化合物进行分析时，设定较高柱温可以使分析时间缩短，并提高定量准确性。

— 80℃下的耐久性考察 —

接下来，在柱温80 ℃条件下对Proteonavi S5的耐久性进行了考察。

图3为首次进样与连续进样第500针所得色谱图，图4为进样500针的环孢菌素A保留时间维持率（％）。

图3 首次进样和连续500次进样所得色谱图

图4 环孢菌素A的保留时间维持率（％）

如图3、4，对Proteonavi S5进行80˚C条件下的连续耐久性试验，在连续500次进样过程中（通液时间共计250小时），环孢菌素A的峰形几乎没有变化（理论塔板数N及对称因子S），同时，保留时间维持率近乎100%（首次进样与第500次进样对比，具体数值为99.4%）。

综上，Proteonavi S5色谱柱即使在80 ℃的高柱温条件下也能得到非常稳定的分析结果。

*耐久性评价方法是将首次进样的保留时间视为100%，将连续进样第500次的保留时间与其对比，计算维持率（%）。

*理论塔板数、对称因子的计算方法根据《第17改正日本药局方 解说书》进行。

对于环孢菌素A这样的大分子化合物，随着柱温的上升，其扩散速度加快，因而峰形会更尖锐。

针对提高柱温的效果，以环状肽类化合物表面活性肽（M.W. 1036.3）作为分析对象，将柱温分别设定为40 ℃和80 ℃进行分析，图5为分析所得结果。

表面活性肽 (M.W. 1036.3)

Surfactin

图5 柱温40 ℃及80 ℃条件下

对表面活性肽的分析色谱图

【色谱条件】

色谱柱：Proteonavi S5; 2.0 mm i.d. x 150 mm

流动相：0.1 vol% HCOOH, H2O / CH2CN= 30/70

流   速：0.2 mL/min

温   度：40 and 80℃

检   测：UV 220 nm

进样量：2 μL

样   品：CH3OH (100 ug/mL)

如图5，将柱温由40 ℃提高到80 ℃，表面活性肽在保留变弱的同时，峰形更尖锐，理论塔板数亦提高了1400。

综上所述，在对肽类化合物进行分析时，在高柱温条件下使用耐久性良好的Proteonavi S5色谱柱（货号：F80201）进行分析，提高柱温是获得尖锐峰形的技巧之一；在缩短分析时间的同时，检测灵敏度和定量准确性也能得到提高。

这期的内容就到这啦，不知道同学们有没有些许收获呢？如果还想了解更多内容，或者想要咨询相关情况，

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