告别基因分型！Nature子刊：石蜡样本蛋白质组为乳腺癌分子分型提供一种新分类方式

尽管乳腺癌的基因组分型取得了进展，但目前的临床试验和治疗决定通常是基于蛋白质水平的信息。临床上常用的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织标本除用于基本的诊断检测外，还能作为系统性检测蛋白质的标本。

加拿大不列颠哥伦比亚大学的研究团队在Nature Communications（中科院JCR一区，IF:14.919）发表了题为“Proteomic analysis of archival breast cancer clinical specimens identifies biological subtypes with distinct survival outcomes”的论文。本研究中，作者对两个不同队列的共计300例FFPE乳腺癌标本进行了全面的蛋白质组学分析，并比较和发现了基于该蛋白质组学结果的疾病分型与基于RNA水平的PAM50分型之间的异同。作者的蛋白质组学分析以临床适用的方式描述了乳腺癌的异质性，确定了潜在的生物标志物和治疗靶点，并为临床乳腺癌的分型提供了参考。

研究思路

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FFPE样本的蛋白质组学的分组设置

乳腺癌组：每个PAM50亚型75个样本，共计300个样本。其中2008-2013队列178个样本，1986-1992队列122个样本。各队列样本的PAM50亚型分布见下图。

正常组：来自乳腺缩小术的正常乳腺组织样本38个。

补充知识

PAM50分型是基于50个基因RNA表达水平的乳腺癌分型：

Luminal A（管腔A型）：激素受体阳性、HER2阴性、低表达Ki-67。肿瘤进展慢，有相对最好的预后。

Luminal B（管腔B型）：激素受体阳性、HER2阳性或阴性、高表达Ki-67。肿瘤进展比管腔A型快，预后稍差。

Basal-like（基底样）:激素受体阴性、HER2阴性。在年轻和非裔美国女性患者中普遍存在BRCA1基因突变。

HER2-enriched（HER2富集型）: 激素受体阴性、HER2阳性。比管腔型进展快，预后差。但通常使用靶向HER2蛋白的药物后有良好的治疗效果。

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技术路线

作者建立了高深度的基于质谱的FFPE蛋白质组学检测流程，并设置3次技术重复。

研究结果

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乳腺癌FFPE蛋白质组学结果

蛋白质组学分析共定量了9088个蛋白，其中4214个蛋白在所有样本中均有检出。作者对这超过4000个蛋白在08-13队列进行分析。08-13队列的病例包含所有四种PAM50亚型的病例，包括所有75例基底样和88例由IHC检测确定为TNBC（三阴性乳腺癌）的病例，因此该队列是作者研究的重点。

作者先检查了08-13队列中蛋白质组学数据和PAM50分型之间的重叠。观察到基底样亚型的良好分离，而管腔A、管腔B和HER2富集亚型聚集在一起。研究者对25%的最强变异蛋白质(n=1054)进行了无监督聚类，共产生了4个稳定分离的簇。这四个基于蛋白质组的聚类部分概括了基于RNA的PAM50亚型。亚型1(n=34)主要由管腔B型(n=18)和HER2富集(n=13)PAM50病例组成。亚型2(n=50)显著富集的基底样病理(n=41)，包括少数HER2富集，但没有管腔型病例。亚型3（n=47）主要是基底样病例（n=31），但也包括HER2富集病例（n=14）。亚型4（n=43）主要是HER2富集（n=26），但包括管腔A（n=8）和管腔B（n=8）病例。值得注意的是，72/73基底样PAM50肿瘤被细分为亚型2和亚型3，其中亚型3显示了最佳的无复发生存(RFS)和总生存(OS)，而亚型2的临床结局最差。

各亚型生物学特征为亚型3高表达的蛋白质参与免疫应答相关通路，具有免疫热性。亚型1具有脂肪酸代谢、分解代谢和氧化还原相关过程的上调。有最差临床结果的亚型2（主要是基底样）显示出基质和细胞外基质(ECM)富集，包括胶原组织、凝血和血管生成过程。亚型2还具有较高的DNA复制和修复功能以及免疫反应相关通路的低表达。亚型4(HER2富集和混合管腔型)富集于基质和ECM成分、凝血、体液免疫反应（补体和免疫球蛋白）和激素受体结合，还显示出低丰度的DNA损伤修复蛋白。

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各亚型特异性表达的蛋白生物标志物

与亚型的生物学特征相一致

作者分析了乳腺癌蛋白生物标志物的丰度包括49个PAM50蛋白，是否与每个蛋白质组簇的生物学特征相一致。在亚型2中，基底细胞角蛋白(KRT5、KRT17、KRT14)高表达，增殖标志物MKI67在亚型2中较高，而在亚型4中较低。管腔型生物标志物包括ESR1、FOXA1和KRT18在亚型3中显著降低，但在亚型1和亚型4中显著升高。Her2生物标志物(ERBB2，GRB7)在亚型1中显著升高。PRKDC是CPTAC(临床蛋白质组学肿瘤分析联盟)报道的一个基底样亚型特异性生物标志物在亚型2中显著升高。

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不同蛋白质组分型的乳腺癌亚型的临床病理特征

IHC临床试验表明大多数亚型2和亚型3患者为ER、PR和Her2阴性，具有高的增殖指数(Ki67)和核心基底样表型(定义为ER−、PR−、HeR2−和[EGFR+或CK5+])。与亚型1和亚型4相比，亚型2和亚型3患者大多接受化疗，且没有激素治疗。与其他亚型相比，亚型2有更高的复发率，并与脑和肺转移相关，这是侵袭性基底样亚群的临床特征，而亚型4与骨转移相关。在调整了临床病理变量的多变量分析中，不同聚类与生存结果之间的相关性仍然显著。

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免疫热型的免疫蛋白特征

免疫热型3具有最佳的预后，作者检测了它是否含有高水平的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。研究者对基质细胞的TILs按低（0-50%）和高（≥50%）类别进行了评分。与其他亚型相比，免疫热型3的TILs评分显著更高且瘤内腔室中的CD8+TILs也显著升高。作者选择了在免疫型与其他亚型之间表达差异最大的4个蛋白通过IHC（免疫组化）评估了免疫型的蛋白质特征。这4个蛋白为TAP1(MHCI类)、HLA-DQA1(MHCII类)、IFIT2(I型干扰素信号)和S100A8，他们在正常的乳房缩小术样本中没有高表达。S100A8、TAP1和HLA-DQA1在免疫热型3中的表达显著高于其他亚型，亚型2的S100A8、IFIT2和HLA-DQA1的表达量最低。

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抗原呈递蛋白TAP1和HLA-DQA1的免疫组化

结果与生存相关

作者评估了TAP1、HLA-DQA1、IFIT2和S100A8的预后价值。TAP1或HLA-DQA1作为单一生物标志物的样本表现出明显更好的RFS(无复发生存)。IFIT2和S100A8与RFS无显著相关性。由于TAP1和HLA-DQA1在抗原呈递过程中发挥作用，使T细胞能够识别和杀死肿瘤细胞，作者检测了它们的联合IHC值的预后价值。高表达TAP1和HLA-DQA1的肿瘤显示出最有利的RFS，而两者均低表达的亚组的RFS最差。只有其中一种生物标志物高表达的亚组具有中间RFS特征。70%（21/30）分类为（TAP1高/HLA-DQA1高）的病例属于亚型3，而90%（76/84）（TAP1低/HLA-DQA1低）的病例属于其他亚型。

作者随后在一个独立的176例乳腺癌队列中进行了验证，结果显示高表达HLA-DQA1作为单一生物标志物有显著更好的生存，而高TAP1的分析趋势也表明其可作为单一生物标志物。这些数据也证实了TAP1和HLA-DQA1IHC高表达的肿瘤的生存率最好，而两者低表达的肿瘤的RFS最差。

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三阴性乳腺癌由四个临床上不同的蛋白质亚型组成

PAM50基底样亚型在临床上近似于TNBC（三阴性乳腺癌）IHC状态。作者想知道当前的蛋白质组学数据是否可以以一种更富含临床信息的方式对TNBC病例进行亚分类。作者分析了88例均在08-13个队列中的，且由IHC定义的TNBC病例(通过基于RNA的PAM50分析为：61个基底样病例，22个HER2富集病例，5个管腔B病例)。使用25%最易变异的蛋白(n=1055)进行无监督分类，确定了4个稳健的聚类，其RFS和OS的预后有显著差异。

TNBC亚型1主要由基底样病例组成，与其他聚类相比，其生存率最高。该聚类的特征是免疫应答、抗原加工和呈递，以及I型和II型IFN信号传导过程。TNBC-亚型1病例TIL含量高，TAP1和HLA-DQA1表达高，因此称为基底-免疫型。

TNBC亚型2多为基底样病例，具有中等生存率，在ECM、凝血和体液免疫反应过程中表达丰富，CLDN3和分化的管腔细胞表面标志物MUC1和EPCAM32的显著低表达，因此被称为间充质细胞。

TNBC亚型3主要为PAM50富集HER2的病例，生存率中等，在脂质代谢、分解代谢和氧化还原过程中富集，具有高表达的腔内细胞角蛋白7、8、18、19和催乳素诱导蛋白(PIP)，因此命名为管腔型。

TNBC亚型4均为基底样病例，存活率最低，DNA复制和细胞周期蛋白富集，免疫相关肽很少以及最少的TILs，因此称为基底免疫缺乏型。

当将TNBC（三阴性乳腺癌）病理的蛋白质组亚型与08-13队列病理的蛋白质亚型重叠时，所有的TNBC亚型1病例都是免疫热型3的成员。相比之下，TNBC亚型2和TNBC亚型4的大多数病例属于08-13亚型2，而大多数TNBC亚型3病例属于08-13亚型4。

7

鉴定三阴性乳腺癌TNBC中与临床结果相关的

蛋白生物标志物

紧接着，作者寻找作为TNBC的候选预后生物标志物。Cox分析确定85个蛋白质与长RFS(无复发生存)显著相关，包括一些免疫相关蛋白，另外18个蛋白质显著与不良RFS(无复发生存)显著相关。作者将这些预后候选蛋白映射到TNBC亚型中。在与良好RFS相关的85个蛋白中，有44个在TNBC亚型1中也显著高表达，只有一个属于TNBC亚型3的特征，没有蛋白与TNBC亚型2或4有显著关联。在与RFS较差相关的18个蛋白中，有4个在TNBC亚型4表现出最差的生存率，而其他均与TNBC亚型相关。

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蛋白质组学显示了管腔型乳腺癌的生物学异质性

86-92个队列中的病例包括使用葡聚糖被覆活性炭测定分类为ER阳性的患者。这110个样本共分析得到三个主要的亚型。亚型1主要是管腔A型，亚型3主要是管腔B型。亚型1高表达RNA处理和剪切过程的蛋白，但是缺乏参与抗原处理和提呈以及I型和II型IFN信号的免疫相关蛋白。亚型2富集基质蛋白和ECM成分，包括一些胶原蛋白成员（称为管腔A基质富集）。与亚型1和2相比，亚型3高表达和DNA复制、细胞周期、DNA损伤反应和免疫反应相关蛋白，包括MHCI类抗原加工和呈递，以及T细胞信号，同时缺乏ECM、凝血、上皮细胞分化和对雌激素和类固醇激素反应的相关蛋白。

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鉴定管腔型患者中与生存结局相关的蛋白

生物标志物

作者通过分析确定脂肪酸结合蛋白-7(FABP7)是他莫昔芬治疗后与>10年RFS相关的唯一候选生物标志物)，与既往文献一致。在公开的数据集中，高FABP7 mRNA的表达与良好的RFS显著相关。86-92队列的临床病理特征显示，86-92亚型3中Ki67增殖标志物的表达显著高于86-92亚型1和2。然而，Ki67与RFS和OS（总生存）无统计学意义的相关性。 

研究总结

作者对来自于两个队列的共计300例FFPE乳腺癌手术标本进行了全面的蛋白质组学检测，共定量了4214个蛋白质。基于蛋白质组学的结果共将乳腺癌病理分为4个亚型，其中一组具有免疫表达特征和良好的生存率。HER2富集的病例根据细胞外基质、脂质代谢和免疫反应特征不同而分为异质性组。蛋白质组学结果将88例IHC定义的三阴性乳腺癌区分为基底免疫型、基底免疫缺乏型、间充质和管腔型，生存结果各不相同。总体，作者的蛋白质组学分描述了乳腺癌的异质性，确定了潜在的生物标志物和治疗靶点，并为临床乳腺癌分类提供了参考。

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