项目文章 | IF=13！TM广靶助力强化结肠癌放疗仿生纳米载体研究

2022年2月12日，西安交通大学第一附属院肿瘤放疗科龚柳云博士（一作），韩苏夏教授和张明真研究员（通讯作者）在材料领域权威期刊Small上发表题为“All-In-One Biomimetic Nanoplatform Based on Hollow Polydopamine Nanoparticles for Synergistically Enhanced Radiotherapy of Colon Cancer”的文章，影响因子13.28分。迈维代谢为该研究提供了代谢组学检测服务。

首先，通过硝酸锌和2-甲基咪唑合成了沸石咪唑骨架8 (ZIF-8)纳米粒子。还通过向反应中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)改性的Pt纳米颗粒来合成Pt@ZIF-8。当反应系统中存在过量的多巴胺时，多巴胺通过螯合竞争诱导的聚合取代2-甲基咪唑，形成Pt掺杂的中空聚多巴胺纳米颗粒(Pt@HP)。通过透射电子显微镜(TEM)扫描ZIF-8, Pt@ZIF-8,  Pt@HP 的颗粒尺寸和形态，证实了纳米颗粒的成功形成(图2A)。Pt@HP是中空结构，其与癌细胞膜碎片混合并在冰浴中搅拌后，这种中空载体被癌细胞膜覆盖，从而获得仿生纳米载体(Pt@HP@M)。western blot和考马斯亮蓝染色的结果显示，Pt@HP@M所包含的蛋白质与细胞膜蛋白质轮廓相似(图2E)，表明膜的功能蛋白质成功地包被在Pt@HP上。AP和VP加载后，在VAPt@HP吸收中出现AP (220 nm)和VP (420和690 nm)的相同吸收峰，表明这些药物成功加载到Pt@HP中(图3C)。FTIR光谱分析进一步支持AP和VP的成功加载，特征峰出现在VAPt@HP中(图3D)。AVPt@HP@M的大小和多分散性指数(PDI)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(含10%胎牛血清[FBS])中7天没有显著变化(图3G)，这表明AVPt@HP@M具有出色的稳定性，有可能用于体内研究。如TEM所示，AVPt@HP@M在三种不同pH值的溶液中保持4小时，并保持pH值为7.4，在pH值为6.5时会发生降解。当pH值降至5.5时，颗粒完整性被破坏并完全分解，这表明AVPt@HP@M将在酸性TME中降解。受AVPt@HP@M的pH响应行为的启发，对AVPt@HP@M在不同pH条件下的药物释放曲线进行了评估(图3H，I)。相比 pH 7.4时，AP和VP的累积释放量在酸性条件下显著增加。

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图2

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图3

用癌细胞膜包裹纳米粒子的伪装策略允许通过自我识别、同型靶向和延长的系统循环来实现优异的肿瘤靶向，从而有助于有效的肿瘤治疗。共聚焦成像显示，与MCF-7和Hela细胞相比，AVPt@HP与HCT-116细胞膜的仿生结合导致了对HCT-116细胞更高的特异性自我识别(图4A)。此外，流式细胞仪分析定量检测显示，HCT-116细胞中Pt@HP@M的荧光高达99.83%，显著高于MCF-7细胞(54.5%)和Hela细胞(67.92%)(图4B)。FE-SEM图像显示HCT-116细胞上有大量Pt@HP@M(用黄色箭头标记)，表明伪装策略介导的主动靶向可以提高纳米颗粒与细胞之间的结合能力。这些结果支持了同源肿瘤的自我靶向和“归巢”能力，同时与其他异源肿瘤竞争。

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图4

缺氧的肿瘤微环境限制了放疗的疗效，增加实体癌组织中的氧含量可以显著提高放射增敏。接下来评估AVPt@HP@M缓解细胞内缺氧的能力。将HCT-116细胞在正常和缺氧培养箱中培养。[Ru(dpp)3]Cl2可指示细胞内氧气水平，并用于检测治疗前后常氧和低氧条件下的氧气水平。[Ru(dpp)3]Cl2的红色荧光越强，表明细胞内氧气浓度越低。常氧组细胞内红色荧光明显弱于缺氧组。HP@M处理4 h后，常氧组和低氧组的红色荧光与对照组相比无明显变化。相反，当用Pt@HP@M处理4小时时，正常氧组和缺氧组的细胞中的红色荧光显著减少，表明Pt@HP@M中的Pt催化氧的产生并缓解缺氧。本文还评估了用纳米粒子处理的辐射(IR)产生的ROS。DCFH-DA是一种ROS探针，常用于检测H2O2 含量和氧化应激。当用IR或AVPt@HP@M处理时，细胞中出现一点绿点，与对照组相比没有显著差异，这可能归因于活细胞内源性产生的ROS。当用IR和纳米粒子(APt@HP@M、VPt@HP@M和AVPt@HP@M)一起处理时，细胞中的绿点显著增加，并且AVPt@HP@M + IR处理组显示出最强的绿色荧光，表明大量ROS产生。AVPt@HP@M纳米颗粒显著增加了细胞内活性氧的水平，具有提高体内放射敏感性的潜力。

通过CCK-8试验评估显示Pt@HP@M的生物相容性很出色。接下来评价在IR下AVPt@HP@M的治疗效果。研究发现，IR或纳米粒子(APt@HP@M、VPt@HP@M和AVPt@HP@M)单独处理对细胞活力有轻微影响。相反，当纳米粒子和IR一起处理时，细胞生长被显著抑制。治疗效果与纳米颗粒浓度呈正相关。AP和VP在降解后从AVPt@HP@M中释放出来，分别作为放射增敏剂和光敏剂，AP和VP被IR激活，对放射治疗产生增敏作用。

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图5

为了保证纳米粒子在体内应用的安全性，有必要对其进行生物安全性评价。接下来在体内评估了AVPt@HP@M的细胞毒性效应。每3天给小鼠静脉注射PBS或AVPt @ HP @ M共4次，并在初次注射后15天和30天收集小鼠血液。血液分析和生化分析结果表明，注射PBS和AVPt @ HP @ M之间无显著差异。 15天和30天后的分组(图S10A，支持信息)。以丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)作为肝脏的损伤指标，以血尿素氮(BUN)和肌酐(CR)作为肾脏的损伤指标评估了AVPt@HP@M对小鼠肝脏和肾脏的潜在损伤。与PBS注射组相比，无论是15天还是30天，ALT、AST、BUN和CR均无明显差异。这些结果表明，AVPt@HP@M对肝脏和肾脏没有造成损害。同时，在多次注射AVPt@HP@M后，所有组的心脏、肝脏、肺和肾脏器官指数均无显著差异。AVPt@HP@M具有良好的生物相容性，在体内具有治疗应用潜力。

红细胞溶血严重限制了纳米粒子的体内应用。本文研究了AVPt@HP@M的溶血能力，结果表明AVPt@HP@M不引起明显的溶血。Pt@HP@M (HCT-116)组肿瘤区域的DiR荧光信号高于Pt@HP@M (HCF-7)、Pt@HP@M (Hela)和 Pt@HP组，验证了Pt@HP@M对同源肿瘤的显著自靶向能力。肿瘤切片的H&E染色显示AVPt@HP@M + IR治疗组比其他组坏死更多。在对照组、IR组和AVPt@HP@M治疗组的肿瘤切片中发现少量TUNEL阳性凋亡细胞(绿点),证明AVPt@HP@M在体内具有良好的生物相容性。同时，AVPt@HP@M + IR治疗组的肿瘤切片显示出比APt@HP@M + IR和VPt@HP@M + IR组高得多的凋亡率(图7E)，表明APt@HP@M + IR抑制了实体瘤中的肿瘤生长。

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图6

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图7

AVPt@HP@M中的AP和VP通过不同的途径发挥放射增敏作用。WB结果显示，VP处理可以降低LC3脂质化表达，并增加选择性自噬底物P62表达(图8A)，表明自噬受到抑制，与以前的报道一致。有缺陷的DSB修复可导致细胞转化、细胞死亡和肿瘤发生。APt@HP@M + IR在结直肠癌(HCT-116和HT-29细胞)中引起DSB积累，AVPt@HP@M + IR引起DSB积累增加。AVPt@HP@M仿生纳米载体同时递送AP和VP，解决了放射治疗中放射增敏剂递送的空间和时间控制的关键问题，从而提高了它们的治疗效果。

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图8

癌症相关蛋白表达的改变可以增加代谢物的水平，从而促进癌症的发生和发展。一些特定代谢物水平的变化可以导致癌细胞中信号通路的改变。使用LC-ESI-MS/MS系统将样品提取物用于代谢物分析，通过该系统分析来自用PBS、IR和AVPt@HP@M + IR处理的小鼠的血液样品。PLS-DA结果如图9A所示，在批量分析过程中，每组中的所有样品都紧密聚集在一起，这表明经过不同处理的样品明显分离。在对照组和IR组中总共鉴定出112种代谢物；在对照组和AVPt@HP@M + IR组之间鉴定出416种代谢物，在IR组和AVPt@HP@M + IR组之间鉴定出153种代谢物。每组中代谢物的最高差异表达如图9B所示。排除批次效应后，75种代谢物被认为是受AVPt@HP@M + IR影响的重要代谢物(图9C)。在用AVPt@HP@M + IR治疗后，最显著改变的代谢途径是嘌呤代谢(图9D)。嘌呤及其衍生物广泛参与生物过程。嘌呤为DNA和RNA提供必需的成分，是器官组织最大的代谢底物。嘌呤也提供了促进细胞存活和增殖所必需的能量和辅因子。值得注意的是，嘌呤抗代谢物是通过阻断DNA合成和停止细胞生长来治疗癌症的最早的抗肿瘤药物。这一过程解释了为什么AVPt@HP@M + IR增加了结肠直肠癌细胞中DSB的积累。另外，嘌呤代谢中的嘌呤体可以影响细胞周期。该过程为AVPt@HP@M + IR治疗组中更多G2/M检查点被激活提供了证据。

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图9

迈维代谢TM广靶检测将非靶（高分辨、广覆盖）与广靶（高灵敏、精定量）完美结合：首先用高分辨TOF对样本进行二级谱扫描，提取MRM离子对信息，再整合广靶库构建样本的特异性数据库，最后利用Q-TRAP对库中物质开展MRM精准检测，极大地提升了有效数据量。

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