项目文章 | 动物领域连续两篇！贝类代谢组、昆虫多组学研究成果

2022-02-17 22:22:47, 小迈武汉迈特维尔生物科技有限公司

前言

本周给小迈给大家带来2篇项目文章解读，第一篇文章采用广泛靶向代谢组学方法探究贻贝在热和缺氧胁迫下的代谢反应，第二篇文章揭示了阿维菌素对意大利蜜蜂和中华蜜蜂的影响有明显不同的分子模式，迈维代谢为两项研究均提供了动物广泛靶向代谢组检测服务。

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解读小视频

文章一

广泛靶向代谢组学方法检测硬壳蛤在热和缺氧胁迫下的代谢反应

● 发表期刊：Science of the Total Environment

● 影响因子：7.963

● 发表时间：2021.10

● 发表单位：中国科学院海洋研究所

研究背景

2021年10月，中国科学院海洋研究所张涛研究团队在Science of the Total Environment期刊上发表了题为“ Metabolic response of Mercenaria mercenaria under heat and hypoxia stress by widely targeted metabolomic approach”的研究文章，探究了硬壳蛤在热和缺氧胁迫下的代谢反应。迈维代谢为该项研究提供了动物广泛靶向代谢组学检测和分析服务。

由于全球变暖，海洋中的溶解氧 (DO) 浓度随着温度的升高而降低，高温和低溶解氧浓度使得养殖的海洋生物面临着不同的风险，甚至大量死亡，对中国的渔业资源造成了严重影响。到目前为止，我们对海洋生物对热和缺氧的联合作用的代谢反应知之甚少。

硬壳蛤是一种海洋双壳类动物，是中国辽宁至广东沿海地区重要的商业贝类养殖品种。然而，随着全球变暖和沿海浅水缺氧增加，高温和缺氧成为威胁其在夏季生理状态的主要环境胁迫。成年硬壳蛤耐温范围为1~34 °C，并且可以在缺氧条件下存活两周。因此，硬壳蛤可以作为理想的模式生物来研究热缺氧条件下的代谢适应机制。本研究采用广泛的靶向代谢组学分析来研究耐热、耐缺氧双壳类硬壳蛤鳃的代谢反应。

研究思路

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研究流程图

研究结果

1、存活率

硬蛤的存活率随着不同的环境压力而变化（图1）。

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图1. 不同处理组硬壳蛤的生存曲线

✦阴性对照组（NC）组所有硬壳蛤均存活，试验持续2天后死亡率为0%。

✦低氧组（LO）所有硬壳蛤均存活，试验持续2天后死亡率为0%。

✦高温组（HT）15 h后首次出现死亡，试验期25、48 h后死亡率分别为3.75%和28.75%。

✦高温加缺氧(HL)组在试验25 h后首次出现死亡，试验48 h后死亡率上升至52.5%。

2、代谢组学特征

从代谢组学水平探索潜在的适应机制，采用广泛靶向代谢组学技术共鉴定出 810 种代谢物，并对其进行 PCA 分析以确定所有组（HL、HT、LO 和 NC）中的代谢物变异。四组样本PCA图聚类良好（图2），表明环境胁迫可能影响了硬壳蛤的鳃代谢组。

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图2. 鳃组织中代谢物的主成分分析(PCA)

图 3A 展示了各比较组中13类代谢物的组成百分比。很明显，脂肪酰类 (FA) 显示出很大的百分比（HL vs. NC为21.54%，HT vs. NC为16.46%，LO vs. NC为 32.61%）。大多数酰基肉碱在实验组中增加。

有趣的是，在LO vs. NC中的 FA类中未发现氧化脂质。然而，氧化脂质如白三烯C4、14,15-白三烯C4在HL vs. NC和HT vs. NC中显着积累。类似的情况还有甘油磷脂 (GP) ，在HL vs. NC和HT vs. NC中发现甘油磷脂分别为 10% 和 20.12%，而在LO vs. NC中未发现差异的 GP 代谢物。此外，在 LO vs. NC中差异的氨基酸及其代谢物仅为 8.70%，在 HL vs. NC 和 HT vs. NC 中，氨基酸及其代谢物的占比分别为 20.77% 和 23.17%。

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图3. 代谢组特征

使用图 3B 中所示的维恩图表示三对成对比较之间的重叠差异代谢物，与阴性对照组相比，各实验组中有16个差异代谢物重叠，所有这些代谢物在实验组中表现出相似的趋势，包括15种上调代谢物（1种游离脂肪酸、9种酰基肉碱、4种有机酸及其衍生物和1种小肽）和1种下调代谢物（甲状腺素）。

为了更好地了解差异代谢物的功能，对各个比较组中显着差异的代谢物进行了KEGG富集分析。图4A显示H与NC相比，丙酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、丙酮酸代谢、磷酸肌醇代谢、维生素消化吸收、非洲锥虫病、蠕虫长寿调节途径和氧化磷酸化显着富集（P < 0.05）。图4B显示在HT和NC的比较分析中丙酸代谢、甲状腺激素合成、丙酮酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、蠕虫长寿调节途径、氧化磷酸化、胰岛素抵抗以及果糖和甘露糖代谢显着富集（P < 0.05)。图4C显示，在LO和NC的比较分析中，柠檬酸循环（TCA循环）、癌症中心碳代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、胰高血糖素信号通路、咖啡因代谢和丙酸代谢显着富集（P < 0.05）。

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图4. 针对差异代谢物的KEGG富集结果。(A) HL vs. NC；(B) HT vs. NC；(C) LO vs. NC

3、通过 ROC 分析选择生物标志物

别使用各实验组（HL、HT 和 LO）与阴性对照组（NC）之间差异倍数最大的20种代谢物进行ROC分析，当代谢物的曲线下面积（AUC值）大于0.9时，视其为生物标志物。

HL vs. NC组比较中所选代谢物的所有AUC值均大于或等于0.9。这表明这些代谢物可能是热加缺氧应激的潜在生物标志物。在 HT vs. NC 组比较分析中，选定的代谢物中有17种都可能是热应激的潜在生物标志物。此外，LO vs. NC比较中有13种选定的代谢物可能是缺氧应激的潜在生物标志物。

4、代谢组对环境应激反应的系统分析（HL、HT 和 LO）

HL、HT和LO组硬蛤的潜在代谢组学反应和适应机制如图5所示。

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图5. 环境胁迫下的假设代谢反应图。（红色表示增加，绿色表示减少）

能量代谢：加热组（HT）的葡萄糖显着高于阴性对照组（NC）组。热+缺氧组（HL）的果糖、甘露糖等糖酵解代谢物比NC组增加更显着，而6-磷酸葡萄糖和6-磷酸甘露糖显着降低，标志着无氧代谢的开始。HL和HT组乳酸含量均高于NC组。缺氧组（LO）中柠檬酸、异柠檬酸和精氨酸（可转化为酮戊二酸）、蛋氨酸（可转化为琥珀酰辅酶A）下调，TCA循环可能受到显着影响。

脂代谢：HL和HT中的氧化脂质（白三烯）增加表明有机体处于 ROS 压力下。肉碱的积累可能会促进脂肪酸 β 氧化以提供能量。甘油磷脂含量的增加可能在细胞膜稳定性中起重要作用。

有机渗透物：在蛋白质热稳定性（单糖和氧化三甲胺 (TMAO) 增加）和 ROS 消除（肌醇和谷胱甘肽增加）中发挥作用。

维生素：包括抗坏血酸盐、泛酸盐和烟酰胺在内的维生素起着重要的抗氧化作用。此外，泛酸可能通过促进磷脂合成的 CoA 帮助维持细胞完整性。

研究结论

探讨了硬蛤在热和缺氧胁迫下的代谢反应。糖酵解、厌氧代谢和TCA 循环受到压力的影响。肉碱的积累可能会促进脂肪酸β氧化。油磷脂的积累可以维持细胞膜的稳定性。渗透剂在缓解 ROS 压力和维持蛋白质稳态中发挥关键作用

文章二

阿维菌素对意大利蜜蜂和中华蜜蜂的影响具有明显不同的分子模式

● 发表期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety

● 影响因子：6.291

● 发表时间：2022.01

● 发表单位：山东农业大学

研究背景

2022年1月，山东农业大学生命科学学院郭兴启教授、动物科技学院胥宝华教授团队联合在Ecotoxicology and Environmental Safety期刊上发表了题为“Distinct molecular impact patterns of abamectin on Apis mellifera ligustica and Apis cerana cerana ”的研究论文，该项研究对比了阿维菌素对意大利蜜蜂和中华蜜蜂的影响差异，并从转录组、蛋白组和代谢组学层面揭示了其影响的分子模式。迈维代谢为该研究提供了动物广泛靶向代谢组学检测和分析服务。

蜜蜂在增加农业粮食产量和维持自然生态系统的稳定性方面发挥着至关重要的作用。近年，蜜蜂在世界许多地方的种群数量迅速下降，导致人们越来越关注对蜜蜂健康产生不利影响的因素，例如农用化学品和病原体。

阿维菌素具有杀螨、杀线虫的特性，因其在控制作物害虫（如甲虫、螨虫）方面的优秀效果而越来越受欢迎。使用农用化学品旨在减少农业杂草和害虫，然而，用于作物保护的阿维菌素也会影响许多非目标昆虫，包括蜜蜂，口服阿维菌素会导致无刺黄花蜂的高死亡率。虽然阿维菌素对蜜蜂有毒性，但其对不同蜂种的影响是否存在差异、对不同蜜蜂的具体作用目前仍不清楚。

研究思路：

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图6. 研究设计

研究结果

1、阿维菌素暴露增加蜜蜂死亡率

为探讨阿维菌素暴露对蜜蜂的影响，实验组每只蜜蜂喂食1L阿维菌素-蔗糖溶液，对照组每只蜜蜂喂食1L蔗糖溶液。我们发现与对照组的死亡率相比，阿维菌素喂养显着增加了两种蜜蜂的死亡率，并且中华蜜蜂的死亡率高于意大利蜜蜂（图7A)，说明阿维菌素对中华蜜蜂的作用强于对意大利蜜蜂的作用。

为了进一步验证这一结果，实验组和对照组的蜜蜂随意喂食阿维菌素-蔗糖溶液和蔗糖溶液。发现随意喂食阿维菌素也会引发蜜蜂死亡，而且中华蜜蜂的死亡率再次意大利蜜蜂（图7B）。这些结果进一步表明阿维菌素降低了蜜蜂的存活率，并且阿维菌素对意大利蜜蜂的不利影响低于（对）中华蜜蜂。

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图7. 暴露于阿维菌素后的蜜蜂存活率Kaplan Meier生存曲线。

A、两种蜜蜂饲喂1 L的阿维菌素-蔗糖溶液，饲喂1L 30%蔗糖溶液作为对照

B、两种蜜蜂被随意饲喂阿维菌素-蔗糖溶液，随意饲喂30%蔗糖溶液的蜜蜂作为对照

2、阿维菌素胁迫下蜜蜂 DEGs 的转录组鉴定

为了揭示阿维菌素对蜜蜂的分子影响，首先对喂食阿维菌素的蜜蜂与对照组（喂食蔗糖溶液的蜜蜂）进行了转录组分析，基于 FC > 1.5 和 P < 0.05 的阈值筛选差异基因。

各组的差异基因数量如图所示（图8A）。值得注意的是，DEG包括属于热休克蛋白 (Hsp) 家族的7个DEG，它们的转录水平均由阿维菌素诱导，这表明Hsp家族可能在防御阿维菌素对A. mellifera ligustica的影响中发挥关键作用。

对DEG进行KEGG富集分析，发现AccAba/AccSuc 和AmlAba/AmlSuc 两种比较方案中获得的DEG共同富集途径包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢和脂质代谢。这些研究结果表明，阿维菌素干扰了蜜蜂的许多重要途径，例如碳水化合物代谢、氨基酸代谢和脂质代谢途径，这可能进一步引发蜜蜂死亡。GO分析显示，在 AccAba/AccSuc 和 AmlAba/AmlSuc 获得的许多DEG与发育过程、代谢过程、免疫系统过程、对刺激和运动的反应有关。这些结果表明，蜜蜂中许多分子功能、生物过程和细胞成分都受到阿维菌素暴露的影响。

进一步进行 RT-qPCR 以确认RNA-seq结果。与 RNA-seq 结果一致，在阿维菌素胁迫下，许多基因的表达水平在Acc中华蜜蜂（图 8B）和Aml意大利蜜蜂（图8C）中发生了变化。

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图8. 暴露于阿维菌素的蜜蜂的转录组谱。

A、中华蜜蜂与意大利蜜蜂相比，表达基因总数和差异表达基因(DEGs)数量增加

B、RT-qPCR检测AccAba/AccSuc中的DEGs mRNA水平，β-actin作为内参

C、RT-qPCR检测AmlAba/AmlSuc 中的DEGs mRNA水平;β-actin作为内参

3、阿维菌素处理下蜜蜂的蛋白质丰度

通过比较喂食阿维菌素的蜜蜂和喂食蔗糖溶液的蜜蜂，进行蛋白质组学分析以揭示蜜蜂中阿维菌素暴露影响的蛋白质和途径。根据 P < 0.05 和 FC > 1.5 的标准，分别在 AccAba/AccSuc 和 AmlAba/AmlSuc 中发现了454个DEP（306个下调和148个上调）和10个DEP（1个下调和9个上调）（图 9A-B )。在Acc中华蜜蜂中，属于角质层蛋白、过氧化还原蛋白、NADH 脱氢酶、CYP450、Hsp 和锌指蛋白家族的多种蛋白质的水平发生了变化，这表明这些蛋白质家族在Acc中暴露于阿维菌素。在 AccAba/AccSuc 和 AmlAba/AmlSuc 之间只有两个 DEP 重叠（图 9A ），这表明阿维菌素对这两种蜜蜂的影响在蛋白质水平上明显不同。

随后进行了GO和KEGG分析，以探索 DEP 的作用和相关途径。GO分析显示AccAba/AccSuc中的许多DEPs参与代谢过程、对刺激的反应、解毒和抗氧化活性，而KEGG分析表明许多DEPs与环境适应、能量代谢、脂质代谢、碳水化合物代谢和氨基酸代谢有关。此外，在AmlAba/AmlSuc 中鉴定的 DEP 主要富集于细胞过程、代谢过程、免疫系统、感觉系统和神经系统。这些结果表明，阿维菌素会干扰许多代谢和信号通路，例如蜜蜂的脂质代谢、碳水化合物代谢、免疫系统和感觉系统，而这些干扰在 A. mellifera ligustica 和 A. cerana cerana 之间存在差异。

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图9. 暴露于阿维菌素的蜜蜂的蛋白质组学分析

4、蛋白质组和转录组的综合分析

为了更好地了解阿维菌素对蜜蜂的影响，我们进行了全面的转录组学和蛋白质组学分析。在 Acc中华蜜蜂中，21个基因的表达水平在mRNA和蛋白水平上都发生了改变（R = 0.2208）；其中三个基因（粘蛋白 5AC 样、麦芽糖酶 1 和几丁质酶 3 样蛋白 1 基因）的变化趋势一致，这三个基因FC值的Spearman 相关系数为0.5（图10C）。在阿维菌素暴露下，未发现任何基因在Aml意大利蜜蜂的 mRNA 或蛋白质水平上存在差异表达（图 10D）。

此外，在Acc中华蜜蜂（R = 0.0064，图 10E）和Aml意大利蜜蜂（R = 0.0328，图 10F）中发现所有定量蛋白质与其相关转录物之间的弱相关性。这些结果表明蜜蜂对阿维菌素胁迫具有复杂的分子反应模式。尽管在转录和翻译水平上发现基因表达的相关性较弱，但在蛋白质组和转录组中都富集到了许多相同的过程和途径，例如，从 AccSuc/AccAba 中的转录组分析和蛋白质组分析中确定了对刺激、能量代谢和碳水化合物代谢途径的反应。这些结果表明，上述过程和途径可能在蜜蜂对阿维菌素暴露的反应中发挥重要作用。

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图10. 暴露于阿维菌素的蜜蜂的蛋白质组学分析

C-D：在 Acc (C)和Aml (D) 中mRNA和蛋白质水平发生改变的基因重叠情况。

D-F：Acc (E)和Aml (F)中所有蛋白质及其相关RNA的倍数变化相关性分析。

DEPs_NDEGs：蛋白质有显着差异，基因无显着差异。

NDEPs_DEGs：蛋白质没有显着差异，但基因有显着差异。

NDEPs_NDEGs：蛋白质或基因没有显着差异。

DEPs_DEGs：蛋白质和基因存在显着差异。

5、阿维菌素处理后蜜蜂中代谢物相对丰度

为了进一步研究阿维菌素对蜜蜂的影响，对喂食阿维菌素的蜜蜂进行了代谢组学分析。用喂食蔗糖溶液的蜜蜂作为对照。分别检测到 A. mellifera ligustica 和 A. cerana cerana 中的 578 和 580 种代谢物。基于 VIP > 1、FC > 1.5 和 P < 0.05 的标准， AccAba/AccSuc中有71 种代谢物显示出丰度变化（51 种下调和 20 种上调），AmlAba/AmlSuc 中有 14 种代谢物出现丰度变化（7 种上调和 7 种下调），值得一提的是，在食用阿维菌素后，两种蜜蜂在同时发生丰度变化的只有两种代谢物（N,N-二甲基甲酰胺和 δ-戊内酰胺）。这些发现表明蜜蜂的代谢状态受到阿维菌素处理的干扰。然而，阿维菌素对 A. mellifera ligustica 和 A. cerana cerana 的影响存在显着差异，与转录组和蛋白质组结果一致。

对DEM进行KEGG分析，以进一步探索阿维菌素对蜜蜂代谢的影响。许多 DEM 与 AccAba/AccSuc 中的能量代谢、消化系统、碳水化合物代谢、氨基酸代谢和神经系统通路相关（图11A-B）。此外，一些 DEM 参与了 AmlAba/AmlSuc 中的氨基酸代谢、脂质代谢、碳水化合物代谢和感觉系统（图11C-D）。这些结果表明，阿维菌素通过影响蜜蜂中各种代谢物的丰度来影响许多重要的途径。

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图11. 暴露在阿维菌素下的蜜蜂的代谢变化与许多重要途径有关

A：阿维菌素对 AccAba/AccSuc 中识别的代谢物类别的影响，以不同颜色显示。数字表示每个代谢物类别的差异表达代谢物 (DEM) 的数量。

B：AccAba/AccSuc 中代谢变化丰度的标准化水平，颜色表示 A中呈现的化合物类别。

C：阿维菌素对 AmlAba/AmlSuc 中以不同颜色呈现的代谢物类别的影响，数字代表每个代谢物类别的 DEM 数量。

D：AmlAba/AmlSuc 中代谢变化丰度的标准化水平，颜色表示C中显示的化合物类别。

6、代谢组-转录组、代谢组-蛋白质组的综合分析

为了更好地了解蜜蜂调控网络对阿维菌素暴露的反应，对经过代谢组学、转录组学和蛋白质组学实验的样品进行了代谢组学-转录组学综合分析以及代谢组学-蛋白质组学综合分析。在 A. mellifera ligustica 和 A. cerana cerana 的许多 DEG 和 DEM 之间以及许多 DEP 和 DEM 之间发现了强正相关（PCC > 0.9）。例如，基因 LOC108000244 的 DEG 与 3-羟基-3-甲基戊烷-1,5-二酸（代谢物 ID：MEDN025）显着相关（PCC = 0.927），蛋白质 XP_028523802与 A. cerana cerana 中的 D-葡萄糖二酸盐（代谢物 ID：MEDN531）显着相关（PCC = 0.936）。这些发现表明，这些DEG和DEP可能直接或间接调节相应代谢物的变化。

此外，在暴露于阿维菌素的蜜蜂中，一些 DEG、DEP 或 DEM 参与了相同的途径（图12A-D）。例如，一些 DEGs 和 DEPs 与氨基糖和核苷酸糖代谢、淀粉和蔗糖代谢有关，许多 DEPs 和 DEMs 与 A. cerana cerana 的柠檬酸循环、氨基糖和核苷酸糖代谢有关（图12A-B)。同时还发现多个DE和 DEM不仅与相同的途径相关，而且在 A. cerana cerana 中表现出很强的相关性（图12E）。例如，β-半乳糖苷酶（蛋白质ID：XP_016915297.1）和棉子糖（代谢物 ID：MEDP233）呈强正相关（PCC = 0.935），两者都与 A. cerana cerana 的氨基酸代谢有关（图12E），表明β-半乳糖苷酶可能直接或间接调节棉子糖的含量并最终影响相应的途径。

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图12. 转录组-代谢组以及蛋白质组-代谢组的综合分析

A：AccAba/AccSuc 中鉴定的相同 KEGG 通路相关的差异基因(DEG)和差异代谢物 (DEM)；

B：AccAba/AccSuc 中鉴定的相同 KEGG 通路相关的差异蛋白(DEP)和差异代谢物(DEM)；

C：AmlAba/AmlSuc 中鉴定的相同 KEGG 通路相关的 DEG 和DEM；

D：AmlAba/AmlSuc 中鉴定的相同 KEGG 通路相关的 DEP 和DEM；

E：在AccAba / AccSuc中识别的涉及相同KEGG通路的DEP（灰色矩形）和DEM（灰色椭圆形）之间的连接网络，绝对Pearson相关系数> 0.9，P <0.01。

研究结论

这项研究结果表明，阿维菌素对蜜蜂健康产生不利影响。阿维菌素暴露后，中华蜜蜂的死亡率高于意大利蜜蜂，且阿维菌素对中华蜜蜂的影响在转录、翻译和代谢水平均大于对意大利蜜蜂的影响。尽管存在这些差异，但在阿维菌素暴露后，意大利蜜蜂和中华蜜蜂的多种途径，包括氨基酸代谢、免疫系统、运动、碳水化合物代谢和发育过程都发生了改变。这两种蜜蜂物种可以通过几个相同的基因家族对阿维菌素应激作出反应，例如 Hsp、CYP450、OBP 和角质层蛋白。需要进一步的研究来探索这些分子缺陷是否会转化为对觅食和行为的有害影响。

科研延伸

迈维代谢作为创新代谢组及多组学研究领导者，建立了创新的 “广泛靶向代谢组”技术，分别构建了植物代谢物数据库和动物代谢物质数据库。其中动物（医学）数据库包含了6000多种代谢物（包括广泛靶向代谢组、广靶脂质组等），为不同的研究材料和方向，提供了开展不同动、植物代谢研究的物质基础。