文献解读 | 蛋白组解析饲粮添加剂对羔羊死后肉质影响

蛋白组解析饲粮中添加番茄红素对羊肉储藏过程中肉质的影响

期刊：Antioxidants

发表时间：2021.01

IF: 5.014

2021年1月，中国农业大学动物科技学院罗海玲教授团队在Antioxidants发表了题目为“The Effect of Dietary Lycopene Supplementation on Drip Loss during Storage of Lamb Meat by iTRAQ Analysis ”的研究论文。本研究基于生理生化分析和iTRAQ数据，发现饲粮中添加番茄红素提高了宰后羔羊的抗氧化能力，降低了宰后储藏过程中的滴水损失，其机制可能是通过改变羔羊肌肉中酶活性和细胞结构相关蛋白的表达来实现的。

氧化反应不仅在活细胞中具有重要的功能，而且在死后肌肉的变化中也会发生，氧化反应会危及肉类的安全性、营养价值和货架期。滴水损失是肉制品质量的一个指标，滴水损失越大，肉的嫩度、多汁度和感官品质就会降低，消费者接受度就越低。抗氧化剂作为保护剂，通过淬灭活性氧来保护细胞器/细胞/组织免受氧化损伤，且植物提取物中的抗氧化剂更符合消费者的喜好。据研究膳食中添加番茄红素可以防止脂肪和蛋白质的氧化，增强颜色稳定性，增加抗氧化剂在羊肉贮藏过程中的积累。然而，饲粮中添加番茄红素的抗氧化能力是否有助于控制肉类储藏过程中的滴水损失仍是未知的，且在贮存过程中涉及滴水损失的关键调控蛋白尚不清楚。本研究旨在探究饲粮中添加番茄红素对羔羊死后胸最长肌抗氧化能力、肉品滴水损失以及与滴水损失相关的关键差异表达蛋白（DAPs）的影响。

样本：

选取30只公羊随机分为3组，分别在饲粮中添加0、200和400 mg/kg番茄红素，育肥3个月后屠宰所有羔羊，收集胴体右侧的第6和第13肋之间的胸最长肌(LT)进行0d和7d的肉质化学成分及氧化参数的分析。收集胴体左侧同样位置的LT切成两部分进行滴水损失（1、3、5、7d）和iTRAQ蛋白组（0、5、7d）分析。

技术路线：

1、肉质化学成分分析：通过比较水分、粗蛋白、乙醚提取物和灰分含量变化分析番茄红素对肉质的影响

饲粮中添加番茄红素对宰后羔羊肉化学成分的影响见表2。发现饲粮中添加番茄红素和储存时间对于肉质化学成分没有显著的交互影响。添加番茄红素对试验第0天和第7天的水分和乙醚萃取物含量均无影响。试验第0天，LP200组粗蛋白质含量显著高于CON组。CON组粗脂肪含量随贮藏时间的增加而显著降低。CON组灰分含量在第0天显著低于LP200和LP400组，且随着贮存时间的延长而降低。

表1. 日粮中添加番茄红素对羔羊肉化学成分的影响

2、滴水损失：通过比较滴水损失差异解析番茄红素的作用

滴水损失随着贮藏天数的增加而显著增加，在第7天达到最大值，但添加番茄红素的样本比对照组显著降低 (图1)。添加番茄红素与贮藏天数之间没有显著的交互作用。在添加番茄红素的情况下，滴水损失在第1 ~ 5天缓慢增加，在第5 ~ 7天急剧增加。与CON相比，LP200在第1天滴水损失较低，而LP400则无显著差异。CON组与添加番茄红素组(LP200和LP400)在第3天和第5天无显著差异。试验第7天，饲粮添加番茄红素组(LP200和LP400)肉品滴水损失均低于对照组，但差异不显著。

图1. 饲粮中添加番茄红素对LT第1、3、5和7天滴水损失的影响

3、抗氧化能力：通过比较T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT分析番茄红素的作用

饲粮添加番茄红素后，羊肉中抗氧化酶活性如图2所示。饲粮补充番茄红素后，总抗氧化能力(图2a),超氧化物歧化酶 (图2b),谷胱甘肽过氧化物酶 (图2c),和过氧化氢酶(图2d)活性显著增加，然而LP200和LP400两组之间无显著差异。

图2. 饲粮添加番茄红素对抗氧化酶活性(第0天)的影响

注：A，总抗氧化酶活性；B，超氧化物歧化酶SOD；C，谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px；D，过氧化氢酶CAT

4、脂类和蛋白质的稳定性：通过比较TBARS、羰基、巯基变化分析番茄红素的作用

CON处理组硫代巴比妥酸活性物质（TBARS）含量最高，在添加200和400 mg/kg番茄红素后逐渐降低(图3A)；不同番茄红素添加组TBARS含量相似。与CON组相比，日粮中添加200 mg/kg番茄红素后，羰基含量降低(图3B)。三种处理间巯基含量差异不显著(图3C)。

图3. 添加番茄红素（第0天）对肌肉中硫代巴比妥酸反应物质、羰基和巯基含量的影响

注：A，硫代巴比妥酸反应物质；B，羰基；C，巯基

5、蛋白组结果分析：通过蛋白定性定量、差异蛋白筛选和注释解析番茄红素引起的蛋白水平调控

利用iTRAQ分析饲粮中添加番茄红素后羔羊肉样品的蛋白质组学差异。结果表明，LP200组与LP400组的滴水损失及抗氧化酶活性无显著差异；因此，我们检测了CON和LP200 (LP)之间的蛋白质谱，以阐明番茄红素在贮藏期(0、5和7天)对羊肉的影响。通过iTRAQ分析共鉴定了6967个独特肽段和1032个蛋白。第0天检测到LP-D0与CON-D0之间343个差异表达蛋白（DAPs），其中178个上调，165个下调。与CON-D5相比，LP-D5中有315个DAPs(196个上调，119个下调)。LP-D7和CON-D7之间共检测到214个DAPs（110个上调，104个下调）。这表明在番茄红素补充和贮藏时间的影响下，蛋白质谱有明显的变化。

GO分析发现DAPs在生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)上都有富集。选择CON组和LP组在第0天(图4A)、第5天(图4B)和第7天(图4C)的DAPs富集的前20个条目进行研究，发现大部分DAPs注释在CC类。在第0、5和7天，在比较LP和CON组时，发现CC类有6个相同的条目(蛋白复合体、胞内部分、膜结合细胞器、胞内膜结合细胞器、细胞核和染色体)。

图4. CON组和LP组在第0天(A)、5天(B)和7天(C) DAPs显著富集的前20个条目

KEGG通路分析发现LP-D0和CON-D0组的DAPs主要富集在碳代谢途径, 心肌细胞中的肾上腺素能信号,氧化磷酸化,心肌收缩,糖酵解/糖质新生,柠檬酸循环, 局灶性粘连和谷胱甘肽代谢(Figure5A)。此外，LP-D5组与CON-D5组的DAPs富集于心肌收缩、碳代谢、心肌细胞中的肾上腺素能信号、内质网蛋白加工、蛋白酶体、局灶性黏附、氧化磷酸化等通路(图5B)。第7天除糖酵解/糖异生作用外，排在前五位的途径与第5天相同(图5C)。此外本研究发现了10条在第0、5、7天相同的富集通路如图5所示。

图5. 基于KEGG分析CON组和LP组在第0 (A)、5 (B)和7 (C)天DAPs富集最显著的前20个条目展示

基于GO和KEGG结果，我们选择了10个候选DAPs(NDUFS7、SUCLA2、SUCLG2、PSMC2、PSMA3、CACNB1、TPM3、TNNC1、MYL2和MYL4)以进一步分析阐明补充番茄红素对滴水损失影响的潜在机制。

PRM检测用于验证iTRAQ分析的可靠性。本研究选择了6个上调的DAPs (NDUFS7, SUCLA2, SUCLG2, PSMC2, PSMA3和CACNB1)和4个下调的DAPs (TPM3, TNNC1, MYL2和MYL4)进行检测。结果和iTRAQ一致。

图6. PRM分析验证iTRAQ DAPs

研究目的：本研究旨在研究饲粮中添加番茄红素对羔羊死后肉质抗氧化能力、肉品滴水损失以及与滴水损失相关的关键DAPs的影响。

研究结果：本试验中，饲粮中添加番茄红素可降低肉品在储藏过程中的滴水损失，提高屠宰后肉品中抗氧化酶活性和脂蛋白稳定性。基于肉类在储藏过程中的iTRAQ数据，鉴定了参与氧化磷酸化、碳代谢、柠檬酸循环(TCA循环)、蛋白酶体和心肌收缩通路的10个蛋白(NDUFS7、SUCLA2、SUCLG2、PSMC2、PSMA3、CACNB1、TPM3、TNNC1、MYL2和MYL4)。综上所述，饲粮中添加番茄红素可通过调控氧化酶、代谢酶、钙通道和结构蛋白的表达，提高宰后羔羊肉的抗氧化能力，减少储藏过程中的滴水损失。饲粮中番茄红素的适宜添加水平为200 mg/kg。

迈维小结：迈维代谢可提供蛋白组检测服务，包括标记蛋白和非标记蛋白产品，并且倡导蛋白组与转录组、代谢组的多组学联合分析，本研究也可对样本进行代谢组检测，蛋白组数据和代谢物数据相互佐证锁定代谢通路，系统阐述科学问题。

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