(IF 28) 揭秘黑色素瘤细胞新状态！剑桥大学癌症研究中心最新合作文章揭示强大的基因表达程序是状态转变的基础

2022-01-29 23:28:42, HHY 上海吉凯基因医学科技股份有限公司

黑色素瘤是从黑色素细胞发展而来的，最具侵略性的癌症之一。尽管对黑色素瘤的基础遗传研究提供了新的治疗方法，但临床结果依然较差，大多数患者迅速获得抗药性。根除黑色素瘤的难点在于其本身具有的高度的异质性和适应性。具体来说，黑色素瘤由多个表型不同的亚群组成，这些亚群对治疗的敏感性可能都不同。然而，诱发这种异质性的机制尚未确定。

在培养的黑色素瘤细胞系和活检样本中，进行的基因表达谱分析已经确定了两种主要的细胞状态，我们称之为melanocytic和mesenchymal-like状态（也被称为未分化状态），其特征是非常不同的转录组。研究表明，黑色素瘤细胞可以在这两种状态之间转换，且可能存在intermediate状态。但无法确定，该intermediate状态是两种极端状态的共生混合物，还是一种具有自己的基因调控网络的稳定状态。

2020年，来自英国剑桥、比利时鲁汶和布鲁塞尔的研究人员在Robust gene expression programs underlie recurrent cell states and phenotype switching in melanoma一文中对该问题进行了探讨。研究者们首先对较小的样本（10种黑色素瘤细胞培养物）进行了分析。基因、KEGG通路和基因调控网络的差异显示有三种不同的细胞状态。接下来，作者在更多的活检样本中发现，之前不确定的intermediate状态，可被一个独特的、由转录因子SOX6、NFATC2、EGR3、ELF1和ETV4所控制的，染色质图谱所证实。单细胞迁移试验证实了这种intermediate状态的迁移表型。利用敲除SOX10后的单细胞的时间序列采样，作者解开了状态转换过程中基因调控网络的变化。

图1 研究设计及对应的结论

基因调控网络（gene regulatory network, GRN）是一个分子调节器的集合，分子调节器彼此之间以及与细胞中的其他物质相互作用，以控制mRNA和蛋白质的基因表达水平。而不同黑色素瘤状态的特征是非常不同的转录组，因此，文章中作者利用SCENIC完成GRN的预测，以区别多种黑色素瘤状态对应的转录状态。

简单来说，SCENIC以转录组表达量作为输入，预测每个细胞中存在的一系列regulon，regulon是指以转录因子 (transcription factors, TFs)为中心，包含TFs调控的靶基因的模块，如图2 a中包含三个regulon。同时SCENIC以AUCell值代表regulon活性，值越高，regulon活性越强 (图2 b)。GRN是指TFs与特定mRNA的TF结合位点之间的调控关系的集合 (图3 b)。

图2 a, 绿色圆圈：TFs，粉色的圆圈：靶基因，连线表示TF调控对应基因，一个TF可调控多个靶基因；b, 热图展示每个细胞（列）内的regulon（行），颜色代表AUCell值，regulon在不同细胞中的活性不同

文章中，基于特定基因，KEGG通路确定10个细胞系的三种状态后，作者利用SCENIC挖掘了影响细胞状态的regulon（图3 a），并构架了对应的GRN（图3 b）。结果表明，melanocytic状态具有高活性的SOX10, TFAP2A, MITF, IRF4, HES6和SOX4，其中SOX10和MITF是黑色素细胞系特异性(melanocyte-lineage-specific)TFs；mesenchymal-like状态下，JUN, SOX9, IRF1, FOSL2, ATF5, NFIB的表达更多；intermediate与melanocytic状态共享SOX10, TFAP2A, MITF；而intermediate与mesenchymal-like状态共享FOSL1, 以及重要的与免疫相关的IRF3和STAT1。最后，有一些regulon（如SOX6, NFATC2, EGR3, ELF1, ETV4）, 是只出现在intermediate状态的。这些数据表明，黑色素瘤存在一个独特且稳定的转录状态intermediate，该状态与melanocytic和mesenchymal-like状态拥有一些相同的特点。

图3 单细胞网络推断揭示不同细胞状态下的candidate regulon a, 部分使用SCENIC分析确定的regulon (行)，以及它们在每个细胞 (列) 中的活性。regulon以TF代表，对于选定的TFs，显示了由SCENIC的RcisTarget步骤预测的DNA-binding motif (PWM)，颜色越深，regulon的活性越强 b, 利用SCENIC建立的一个高置信度的GRN。点代表基因，点的颜色代表对应基因的表达量，连线代表存在TF-靶基因

扩大样本量验证过程中，不同黑色素瘤状态下发现了相似的regulon的表达 (图4 a)。此外，作者在umap图中，利用关键regulon的表达量对细胞着色，描述了regulon在不同细胞中的分布。

图4 在较多样本和活体组织中验证细胞状态。a，前期选择的regulon(行)在26个新的和7个以前的细胞系 (列) 中的AUCell值，细胞系被分为melanocytic、intermediate和mesenchymal-like状态。b, 单细胞活检池中的恶性细胞，包含melanocytic状态（SOX10和MITF regulon高活性）和intermediate状态（SOX6、NFATC2和EGR3 regulon高活性，通过AUCell测量）。

SOX10的敲除导致了细胞状态转变，结合时序推断，作者给出了调控转变的GRN。分析发现，SOX10敲除后，细胞周期停止，黑色素细胞的核心程序被关停，该过程可被SOX10，MITF regulon的丢失证明，然后，CEBPZ, MYC TFs停止，几乎同时，未折叠蛋白反应，AP-1活性增强，ATF/FOSB, 免疫相关的TFs IRF/SFAT被激活。

总之，作者利用单细胞转录组结合GRN、时序推断将基因调控的变化对应到黑色素瘤状态的变化。结果表明，转录组和表现型的异质性可极大归因于GRN，同时，状态转化也由GRN控制。

【参考文献】

Wouters, J., Kalender-Atak, Z., Minnoye, L., Spanier, K. I., De Waegeneer, M., González-Blas, C. B., ... & Aerts, S. (2020). Robust gene expression programs underlie recurrent cell states and phenotype switching in melanoma. Nature Cell Biology, 22(8), 986-998.

Verfaillie, A., Imrichova, H., Atak, Z. K., Dewaele, M., Rambow, F., Hulselmans, G., ... & Aerts, S. (2015). Decoding the regulatory landscape of melanoma reveals TEADS as regulators of the invasive cell state. Nature communications, 6(1), 1-16.