超越药典方法的策略——以QbD的理念建立具备稳定性指示能力的依巴斯汀有关物质分析方法

本文编译自以下文献：

本文以QbD理念开发了具备稳定性指示能力的超高效液相色谱(UHPLC)方法，该方法不同于欧洲药典各论收载的有关物质分析方法，用于依巴斯汀原料药及其制剂的有关物质检查。

此新方法以Waters Acquity UPLC BEH C18、50mm×2.1mm、1.7μm为色谱柱，以10mM 醋酸铵缓冲液（pH6.2）为水相，以乙腈/异丙醇（1:1)作为有机相，梯度洗脱，本方法确保伊巴斯汀及其工艺杂质、降解杂质能完全分离。通过色谱建模软件构建模型，将质量源于设计(QbD)理念引入分析方法开发，实现“设计空间”的可视化。验证研究表明，所建立的设计空间模型是准确的。然后通过改变多个参数来研究分析方法的稳健性，包括参数、温度、流动相组分以及流速等。根据先前构建的设计空间内的可用范围，在所有模拟色谱条件下，各组分均可达到分离度不小于2.0的目标。

为了证明方法的稳定性指示能力，进行了依巴斯汀的强制降解（酸/碱水解、氧化、光照和热降解条件）实验结果的分析。工艺杂质、降解产物和API 的所有色谱峰均可实现基线分离。总运行时间仅为4 分钟，与欧洲药典中公布的方法相比，生产率提高了40 倍，并允许每天进行360 多个样品的测试。

依巴斯汀（1-(4-叔丁基苯基)-4-[4-(二苯基甲氧基)-1-哌啶基]-1-丁酮），是第二代非镇静抗组胺药，主要用于过敏性鼻炎，并制备出不同的药物制剂（片剂、口服分散片和糖浆）。依巴斯汀被收载于欧洲药典7.0版，其有关物质分析方法规定以Spherisorb氰基填料（250mm×4.6mm，5μm）为色谱柱，以35% 乙腈和 65vol% 磷酸溶液（pH=5.0）为流动相，流速为1ml/min。根据合成路线，杂质A、C、D和E作为工艺杂质，杂质B、F和G是潜在的降解产物（见图1），需将上述化合物作为有关物质加以控制。其中，依巴斯汀及其有关物质结构见图1，欧洲药典公布的典型图谱见图2。

图1：依巴斯汀及其杂质

图2：依巴斯汀有关物质典型图谱（欧洲药典7.0版）

系统适用性要求杂质C和D峰的分离度应不低于2.0。图2显示：各组分的保留因子k值介于0.25和70之间，与2和20之间的推荐k值相距甚远，尤其是主成分依巴斯汀和杂质E、F、G，保留时间超过50分钟，扩散效应导致峰展宽，峰高降低且峰型变差，进而导致理论塔板数、灵敏度下降。此外，单次运行需要160分钟，严重影响常规检测效率；同时磷酸溶液在pH5.0条件下无缓冲能力；另外色谱柱填料中的氰基易降解，减弱色谱柱能提供的偶极作用，导致两组关键物质对的分离度降低。因此欧洲药典各论收载的有关物质分析方法的耐用性将极其糟糕。

基于上述情况，实验室有必要建立一种简便、快速、可靠、稳定的UHPLC法测定依巴斯汀原料药及其制剂的杂质。以往常见的开发液相色谱分析方法的策略是试错法，通过一次改变一个条件以检查关键物质对色谱峰的分辨率，直到找到最佳方法。这种方法开发的方式耗时很长，同时需要汇总大量数据。当以此方式建立的分析方法转移到另一个实验室时，由于开发方法时未考虑各因素之间的相互作用，常常导致分析方法耐用性很差。

ACD/AutoChrom等专用的QbD工具软件，可以基于少量实验数据，预测在改变流动相组成或pH、柱温的情况下模拟色谱峰的移动。使用此类工具是高效率高质量开发出方法的有效辅助手段。尤其是进行两因素及以上的DoE，能够令研究者更深刻的了解

1. 实验策略

基于QbD的理念，首先定义分析方法目标；再根据目标进行风险评估，并进行色谱条件筛选，明确色谱条件的关键因素；以关键因素进行优化步骤的实验设计，并建立模型，确认最佳条件，建立设计空间，选择最优条件并验证；最后进行分析方法验证（必要时转移）。

2. 定义分析方法目标

A：缩短分析时间（＜10min），提高分析工作效率。

B：确保所有组分的分离度大于2.0。

C：建立分析方法的知识空间，确立操作空间，确保分析方法的稳健性。

3. 风险评估

根据分析方法的目标，最关键的目标是分离度。分离度公式如下：

基于公式及下图中的关系，明确关键因素。

图3：分离条件对k、α、N的影响

4. 实验设计策略

先筛选，后优化。基于风险评估的结果，梯度时间t_G、温度T、强洗脱剂B的组分、水相的pH这四个参数对选择性有较强的影响，且上述条件均为连续变量。因此在筛选色谱柱后，对上述连续变量建模优化。

5. 方法筛选

选择Waters Acquity UPLC® H-class系统（配备流动相切换系统、色谱柱筛选系统、自动进样器、PDA检测器）；配备Acquity UPLC® BEH C18、HSS T3、BEH Phenyl、HSS C18 SB（规格均为50mm×2.1mm、1.7μm）四种填料的UPLC色谱柱；以10mM乙酸缓冲液（pH6.2）作为流动相A；以甲醇/乙腈/异丙醇为流动相B，并以0.5ml/min的流速进行梯度方法筛选。以确认色谱柱和有机相种类。筛选结果表明：使用Acquity UPLC® BEH C18 色谱柱与乙腈或异丙醇的组合进行梯度分离，依巴斯汀及其杂质的最小分离度大于2。结果汇总见图4。

图4：色谱条件筛选结果汇总

6. 方法优化

6.1. 

基于第5项下的筛选结果，结合第3项下的风险评估，选择Acquity UPLC® BEH C18色谱柱，以DoE策略进行后续的方法优化，选择的因素及水平见表1。

根据表1，建立2×2×3个色谱条件进行实验，并以色谱模拟软件进行建模，将上述3因素数据两两建模，结果见图5。

备注：图5红色区域（高温）表明分离度满足要求（Rs＞2.0），蓝色区域（低温）表明分离度达不到要求（Rs＜0.5）。

图5：3个两因素模型

图5结果表明：

将上述3个二维模型合成一个3维模型来查看，可以模拟空间中任意位置的色谱图，并显示对应的色谱条件。实验员根据模型找到了“隐藏的”最优条件（即12个原始实验数据均不在最佳条件上，软件利用数学原理计算出最优解）。模型见图6。

图6：整合后的3维模型

6.2. 

在另外一组实验中，科学家研究了水相pH值的影响。选择兼容质谱的醋酸盐。与此同时，基于流动相pH值与B%对于离子型化合物保留行为的显著影响，科学家进行pH值×t_G的两因素DoE实验，并建立模型。模型表明：pH值在6.0- 6.4 之间，梯度时间t_G为3- 5 分钟之间，分析方法的耐用性可以得到保证。且分离度大于2.0，模型如图7所示。

图7：Rs与 pH值×t_G的二维分离度模型

结合6.1与6.2两个优化实验结果，利用模型选择色谱条件见图8。

：

图8：拟定的色谱条件

以拟定的色谱条件分别模拟色谱图，并进行实验，对比模拟色谱图和实验所得色谱图，见图9。

图9：模拟图谱与实验所得图谱

7. 模型验证

根据模型研究结果，选择部分参数进行实验，以考察模型预测结果与真实实验结果的差异。结果表明模型符合预期。分析方法耐用性佳，第6项下色谱条件可以用于分析方法验证。模型验证结果汇总见图10。

图10：模型验证结果汇总

8. 方法验证

按照ICH Q2的要求进行分析方法验证，所有结果均满足要求。验证结果汇总见图11。

图11：分析方法验证结果汇总

本文以QbD理念，开发一种稳定、快速和可靠的UHPLC方法，满足了既定目标；并建立了可视化的分析方法知识空间，确认了分析方法的操作空间；同时大大提升了样品检测效率，将运行时间由原来的160min/sample缩短至4min/sample，每天可以检测约360批次样品的有关物质。

另外，以QbD理念建立的依巴斯汀原料药及制剂有关物质分析方法，从制定研究计划开始，到方法验证结束完成报告，耗时3周，其中实验过程仅耗时1周。方法转移过程中也未出现偏差。

此次分析方法的变更，极大地降低了研发分析、QC实验室的实验成本（包括溶剂损耗、仪器折旧、人力资源等）；同时提升了研发分析、QC实验室的工作效率，分析方法转移过程也实现了知识空间的完全转移，降低QC实验室后续的偏差风险，显示出了极高的性价比，此分析方法也被审评机构认可。

图12：依巴斯汀及其杂质的pH-logD曲线以ACDAutoChrom软件绘制

从本图可见，本文所选的pH处于远离pKa的环境内，也即pH的微扰不会显著影响方法的稳健性。本文方法选择的pH中心点为6.2，耐用性范围在6.0-6.4之间；EP9.6版本依巴斯汀各论收载的有关物质分析方法确定的流动相水相pH为6.0。因此虽然6.2不在醋酸盐的缓冲范围之内（3.7-5.8），由于风险较低，依然可以使用。

遵循和使用药典方法是进行仿制药方法开发过程中重要的命题。如本例所示的药典方法，运行时间很长，方法灵敏度低而且经济性差，显然对任何使用这个方法的单位都是一个挑战。要提高工作的效率，方法开发研究可以在药典方法的框架内进行方法的变化，例如采用小粒径的短柱来显著降低方法的时间，也可以跳出药典方法的限制来开发符合企业自身能力和设备条件的方法。本文就是一个很好的案例，为仿制药的分析方法的更新提供了参考。使用AQbD软件，进行合理的多因素实验设计，通过数学建模的方式构建模型，获得专属性和耐用性高的方法，这种理念和策略与即将发布的ICHQ14互为表里。跳出药典方法的某些桎梏，以理论为依据，以数据做支撑，必然会获得审评支持，并为企业带来更多收益。

——ACD/Labs 阎作伟