看了这篇文章，我决定用Octet®测一把结合动力学

2021-11-18 07:55:09, 陈老湿德国赛多利斯集团

前言

生命体一般通过细胞表面的受体和配体的结合来感知和响应环境信号。在豆科植物与固氮菌的共生系统中，固氮菌脂壳寡糖（LCO，lipochitooligosaccharide）信号通过与共生植物的单次跨膜受体激酶识别并结合，从而激活下游信号并促进根瘤形成。这些受体包括胞内活性激酶(Medicago LYK3/Lotus NFR1), 和含有假激酶的结构域激酶(Medicago NFP/Lotus NFR5)等。然而，植物受体在感知底物时是如何从静止态转为激活态的，相关的结构和功能研究仍很欠缺^[1][2]。

丹麦奥胡斯大学近期发表在PNAS上的一篇研究中，通过解析LCO受体NFP的结构，并比较NFP、LYS11和NFR5与LCO结合动力学（kinetic，结合速率与解离速率检测），发现LCO与共生植物受体间的解离速率对受体信号的激活至关重要。本文至少一半的数据都是用可以检测解离速率的、基于生物层干涉技术（Biolayer interferometry, BLI）的Octet®分子互作分析系统检测LCO和LCO受体之间的结合动力学。

案例分享

Octet®检测LCO和受体的结合动力学

LCO是一种可溶性较差的多糖物质，将末端活性羟基合成一个糖胺，然后共价偶联生物素，生物素和多糖结构间存在一个linker，这样就可以将LCO固化在SA（链霉亲和素）传感器上，与受体进行结合解离，并且不会改变LCO的活性结构。

LCO的两步法生物素化修饰示意图

用Octet®检测动力学，只需要多糖配体固化、平衡、受体结合解离等步骤，本研究大概15分钟就可以完成一轮实验，并同时检测8个浓度（Octet® Red96）。

用SA传感器固化多糖配体，与NFP进行结合解离，结果显示，共生菌苜蓿根瘤菌(S.meliloti)的LCO-V和NFP之间具有高亲合力；而非NFP共生菌百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)的LCO-V，及几丁质（chitin）不能和NFP结合。

Octet®检测LCO和NFP的动态结合

该研究通过分析NFP的LysM2结构域，发现NFP及其同源蛋白具有一个保守的疏水补丁(hydrophobic patch) ，主要由氨基酸残基L147和 L154形成。将这两个位点突变后，NFP依然结合LCO的结合，但是结合速率（kon）加快了4.5倍；解离速率更是加快了59倍，表明疏水补丁具有稳定NFP和LCO结合的功能。而功能学实验发现突变型NFP不能产生共生信号通路。就是说，不是配体受体有结合就行，两者解离速率也非常重要！

野生型和突变型NFP与LCO的结合动力学

改造的LYS11可以介导菌根共生

LYS11也具有疏水补丁，但是LYS11并没有介导菌根共生的功能。Octet®实验证明，与NFP不同，LYS11可以同时结合百脉根根瘤菌的LCO和几丁质，它们之间的结合和解离速度都非常快。研究人员改造了LYS11（ENG-LYS11），降低了与LCO的结合和解离速度（从>0.12s^-1到0.01s^-1），然后改造后的LYS11也可以诱导共生信号通路了！

总结一下

本文通过比较NFP、LYS11和NFR5与LCO结合的特性和结合解离动力学，提出了LCO通过与其共生植物受体间的动态结合来激活受体信号。更重要的是，对不能介导菌根共生的受体进行工程改造可以有效地激活菌根共生信号，为植物中受体工程改造与分子育种创造了新的思路。受体配体的结合是激活信号的必要条件，但是可能结合动力学才是充分条件！目前，基于BLI的Octet®是检测结合动力学的金标准之一，已经被写入美国药典（点这里）。所以，快找个地方用Octet®测一下动力学吧！

-参考文献-

[1] PNAS｜详解！丹麦奥胡斯大学揭示固氮菌底物LCO激活共生植物受体信号的动态机制. Mol Plant植物科学

[2] Kinetic proofreading of lipochitooligosaccharides determines signal activation of symbiotic plant receptors.PNAS,2021

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