三维立体成像是生命科学、化学、材料等研究中的常用技术。但是，常规的三维成像技术需要对研究样本进行逐层扫描，然后用计算机合成三维图形的方法来了解物体结构。在进行逐层扫描时，被扫描对象必须在整个过程保持静止。因此，常规的三维成像技术在研究快速动态过程时存在一定的局限性。
为了解决这一问题，数字全息显微成像技术应运而生。该技术无需特殊标记，利用光的干涉现象，通过二维图像直接提取研究对象的三维时空信息，是一种免标记、非扫描的三维成像技术，在检测生物体的快速运动过程以及三维形貌测量的研究中展现出广阔的应用前景。
本次OLYMPUS生命科学特邀华南理工大学材料科学与工程学院龚湘君教授及其课题组成员撰文介绍数字全息显微成像技术及其在微生物和细胞研究中的应用。
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华南理工大学材料科学与工程学院
全息术(hologram)，是一种通过记录物体光波信息，从而实现其三维图像再现的技术。1947年，英国伦敦帝国科技学院的匈牙利裔物理学家伽博(Dennis Gabor)提出了全息的概念，使用化学胶片记录下了首张全息图[1]，并由此获得了1971年的诺贝尔物理奖。此后，全息术发展出了全息摄影、全息投影、全息储存和全息防伪等一系列技术，并已广泛应用于科技、娱乐、工业等领域。而在显微成像领域，通过结合全息学、傅里叶光学和数字图像处理等技术，发展出了一种新型显微成像方法—数字全息显微术，即可在常规光学显微镜的基础上，实现无损、免标记、快速定量的三维成像检测。数字全息显微镜(Digital holographic microscopy，简称DHM)，是一种利用光的干涉现象，提取样品三维信息的光学测量技术。该技术在普通光学显微成像的基础上引入了干涉，从而把平面成像时失去的反映高度的相位信息保留在干涉条纹中，由相机对其进行记录，并通过后续计算模拟光在空间中的传播，重建包含目标在内的特定三维空间内的光场，从而实现对样品表面的准三维成像。图1. (a)数字全息显微图像；(b)重建样品表面三维相位图[19]。根据不同角度，数字全息显微镜有不同的分类方法，它们形式各异，但基本的原理是一致的。- 如按全息图记录方式，可以分为同轴全息显微镜及离轴全息显微镜；
- 按观测样品方式，可以分为透射全息显微镜及反射全息显微镜；
- 按相干光的路径分类，可以分为分光式数字全息显微镜及物参共路的数字全息显微镜。
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图2. 同轴透射DHM(左) 和 同轴反射DHM (右)
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图3. 离轴透射DHM(左) 和 离轴反射DHM (右)
与传统的光学显微成像相比，数字全息显微成像能通过计算获得样品的相位信息。这使其可应用于生物医学领域，譬如实现对细胞的实时三维形态观测；而在表面检测领域中，数字全息显微镜可观测样品表面精细的三维形貌，从而对表面缺陷进行定量的动态测定与分析。
记录一张基础的全息图，需要携带样品信息的物光与用于产生干涉的参考光同时照射在记录平面。同轴数字全息，就是在参考光与物光方向基本一致的情况下获得全息图。
为了保证相干性，参考光与物光来自同一个光源，最简单的方式是使用低相干光源，如LED光源照射在观测样品上，光通过样品发生散射，其散射光与周边空白区域发生干涉形成环状的干涉条纹(如图4)。![]()
图4. 同轴数字全息原理示意图该方法结构简单，稳定性好，也能够较为便捷地从普通的光学显微镜改造而来。华南理工大学龚湘君课题组基于奥林巴斯倒置显微镜(Olympus, IX83)，在透射光源处添加准直笼式LED光路，搭建了可实现3D实时检测的数字全息显微镜(如图5)。
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图5. 同轴数字全息显微镜装置图。(a)准直笼式LED光路示意图[2]；(b)装置说明图；(c)基于倒置显微镜(奥林巴斯，IX83)搭建的同轴透射全息显微镜；
还可以极大减少后续散斑噪声及寄生干涉条纹等相干噪声对全息图的影响，提高成像质量。数字全息在观测中不需要进行染色等影响生物活性的制样过程，因而特别适合用于研究细菌等微生物在溶液及界面附近运动行为。
华南理工大学龚湘君课题组使用同轴数字全息显微镜对大肠杆菌在降解表面附近的运动轨迹进行追踪观测，进而分析此界面对细菌粘附等行为的影响及防污效果[3]。
视频2：用于追踪大肠杆菌三维运动轨迹的重建光场聚焦图
在此基础上，该组还使用数字全息显微镜监测了在交流电(AC)电场作用下，大肠杆菌在通电表面附近的三维运动(如图6)。通过对不同周期的交流电场下空间轨迹进行对比，他们发现大肠杆菌的粘附行为与交流电场的周期密切相关，为利用电场进行废水处理和海洋防污提供了启示[4]。
同时，他们还研究了入射光功率、照明均匀性及像素大小等因素对DHM轴向跟踪分辨率的影响，并在计算中引入基于局部最大强度搜索和高斯拟合的三维定位算法，进而有效提高了颗粒的轴向分辨率[5]。
在数十微米深的观测范围内，该算法对0.2 μm的聚苯乙烯颗粒的轴向定位精度可达58 nm。
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图6. 大肠杆菌在ITO表面附近的3D轨迹。(a)没有电场的HCB1；(b)在T = 10 s的交流电场下的HCB1；(c)在T = 0.1 s的交流电场下的HCB1；(d)没有电场的HCB1414；(e)在T = 10 s的交流电场下的HCB1414，(f)在T = 0.1 s的交流电场下的HCB1414[4]。此外，由于同轴数字全息镜分析的对象是散射产生的干涉环而非样品粒子本身，故同轴数字全息镜可突破传统光学系统中衍射极限的限制，观察极小颗粒的运动。
如图7 展示的是纽约大学的Wang等使用同轴数字全息装置对沿着微流通道流动的胶体中牛胰岛素集合体进行观测，并结合了Lorenz-Mie光散射理论，对胶体中亚可见牛胰岛素集合体的三维空间位置、半径ap和折射率np进行统计分析[6]。
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图7. 3000个亚可见牛胰岛素集合体的实验数据，每个数据点代表单个集合体的特性，颜色表示在(ap, np)平面中观察的相对概率密度r(ap, np)[6]。然而，以上应用不能观测样品表面的整体形貌。因此，部分研究者在同轴全息的基础上分别提出了相移数字全息及离轴数字全息，用于实现三维形貌的表征。
为了抑制全息图中的零级和衍射共轭像，1969年Crane首次明确提出了相移干涉测量的概念[7]。相移数字全息通过改变相干光束之间的光程差对同一样品记录多幅相移干涉图，进而计算获得整体相位。
1998年，Zhang等人提出相移数字全息，利用同轴数字显微镜获得多幅全息图像，计算出了花粉颗粒的大小及位置关系[8]。2004年，美国的G. Popescu教授课题组用同轴数字全息显微方法测量了海拉细胞(HeLa Cell)的分裂和人体血红细胞的三维形貌，轴向测量精度达到了26 nm[9]。![]()
图8. 左：分裂中海拉细胞相衬图；右：血红细胞相衬图[9]。
由于需要记录多幅全息图，故相移数字全息需要在时间或空间上进行取舍。时间相移法记录的是时间顺序上的多幅相移干涉图，结构简单，实现容易，但只适用于静止或准静止的样品；空间相移法通过多个CCD相机或利用同一CCD的不同区域同时记录多幅相移干涉图，可以测量动态变化过程，但是结构复杂、成本更高，还存在图像的对齐等问题。
相移数字全息镜可以获得样品的整体相位图，实现了对相机带宽的最大利用，但由于需要进行相移，需要高度精确的相移器，如压电陶瓷(Piezoelectric Transducer，简称PZT)、偏振相移器以及光栅等，价格高昂且不可避免存在相移误差、环境振动等不确定因素，在使用范围上受到较大限制。1962年美国科学家Leith和Upatnieks创新性提出了离轴全息术，将通信理论中的载频概念推广到空域中，实现了实像与共轭虚像之间的分离[10]。
离轴全息方法通过在参考光传播方向上引入一个有限制的倾角的方法，解决了原本同轴全息方法中的“孪生像”问题，大大提高了全息图像的精度。离轴数字全息镜通过频谱滤波的方式获取实像，不可避免会牺牲一定的带宽，但其单张全息图还原相位的优点可以方便地进行动态观测。![]()
图9.离轴全息孪生像分离示意图，其中0xy为全息图平面；0δη为观察平面；
d为重建距离；Ψ(δ, η)为重构波前[10]。
2008年，瑞士C. Depeursinge课题组使用两种波长(657和680 nm)的数字全息显微装置对在石英基片上用铬蒸镀的微台阶表面形貌(高约8.9 nm)进行了三维测量分析，实现了高精度的三维形貌观测[11]。
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图10.左：DHM装置获得的薄台阶高度标准品的三维图，其实际面积为0.8 x 0.7 mm2，周围结构指向已校准的8.9 nm台阶；右：水平获取的DHM轮廓测量值作为单个中值轮廓给出，分别对λ1，λ2和均值的h为9.09 ± 1.27 nm，8.20±1.00 nm和8.65±0.83 nm[11]。
由于离轴数字全息镜是依据光程差获得表面三维形貌的，对于空间中的微纳粒子，如悬浮的细胞仅能获得一个方向的三维形貌，且对凹面不敏感。为此，研究人员提出了通过对样品粒子的各个方向进行成像获得其整体三维模型的方法。2014年， Memmolo等人通过控制红细胞进行翻转并记录红细胞在不同倾斜角度下的全息图，对每张图像红细胞重建结果的去耦程序计算的方式，最终获得了红细胞的3d模型图[12]。图11. 上：(a)全息装置示意图；(b)红细胞翻转示意图；(c)和(d)不同角度下的全息图；下：(a)理想红细胞三维模型；(b)SFS重建获得三维模型；(c)新方法获得三维模[12]。 近年来，廉价的激光器及更小像素单位的相机为数字全息显微镜进一步提高精度提供了硬件条件，电脑算力的大幅提升使得数字全息显微实现实时动态结果输出成为可能。
在研究中，通过改变光路结构，使用双波长、三波长光源以进一步提高测量深度的多波长的数字全息显微已经出现[13,14]；提出新的全息重构算法及图像降噪算法，并通过各类仿真计算进行验证，也成为提高数字全息成像质量的研究热点[15,16]；通过神经网络的深度学习，提高重构速度和精度，进一步优化成像的研究也出现在人们的视野里[17,18]。图12. 通过深度神经网络训练，使用全息图快速输出对象的无伪影相位和振幅图像[18]。另一方面，数字全息显微镜被应用于生物细胞检测与监测(如图13)、微光学测试、MEMS形貌与变形测量、流场及粒子场测量、振动分析等领域，其潜力正在被逐步发掘。
图13. 数字全息显微镜应用：(a)分辨率目标(25×25 μm，452×452像素)；(b)SKOV-3卵巢癌细胞(60 x 60 μm，404×404像素);(c)SKOV-3卵巢癌细胞(60×60 μm，404×404像素);(d)红细胞(50×50 μm，404×404像素)；(e)脸颊上皮细胞(60×60 μm，404×404像素);(f)沙子的石英晶体(60×60 μm，404×404像素)[19]。快速、精确进行微观三维成像是一个基础科学研究中的重要问题，而传统的共聚焦显微镜、原子力显微镜等方法都存在需染色标记、费时等局限。而作为一种非接触、无标记、无损伤的快速定量三维成像方法，数字全息显微镜使得我们能在基本不引入外界干扰的情况下实现对微尺度颗粒进行无标记、原位、实时三维观测，获取其空间三维信息随时间的变化。但由于相机尺寸及分辨率上的限制和激光散斑等因素的影响，数字全息显微镜较难获取样品高频信息，不能进行大面积观测，在颜色还原也存在困难。目前，数字全息显微镜日渐成熟，而随着计算机图像处理和深度学习算法等研究的进一步深入，以及激光调制技术的改良和科学相机在精度及采集速度上的突破，在不久的将来，这项技术将会被应用于更多微观领域的研究乃至高精器件的生产检测中，绽放其独特的光辉。作为光学和数字技术的领先显微镜制造商，奥林巴斯提供了一系列显微镜系统，用于最具挑战性的成像研究。研发出的正置、体视、倒置、共聚焦、多光子和超分辨率显微镜系统，不但具有卓越光学性能，还具有良好的系统开放性和兼容性，并提供几乎满足所有数字成像需求的显微镜物镜，为您的高端个性化成像研究添翼助力。
参考文献
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图4. 同轴数字全息原理示意图
图5. 同轴数字全息显微镜装置图。(a)准直笼式LED光路示意图[2]；(b)装置说明图；(c)基于倒置显微镜(奥林巴斯，IX83)搭建的同轴透射全息显微镜；
图6. 大肠杆菌在ITO表面附近的3D轨迹。(a)没有电场的HCB1；(b)在T = 10 s的交流电场下的HCB1；(c)在T = 0.1 s的交流电场下的HCB1；(d)没有电场的HCB1414；(e)在T = 10 s的交流电场下的HCB1414，(f)在T = 0.1 s的交流电场下的HCB1414[4]。
图7. 3000个亚可见牛胰岛素集合体的实验数据，每个数据点代表单个集合体的特性，颜色表示在(ap, np)平面中观察的相对概率密度r(ap, np)[6]。
图8. 左：分裂中海拉细胞相衬图；右：血红细胞相衬图[9]。
图10.左：DHM装置获得的薄台阶高度标准品的三维图，其实际面积为0.8 x 0.7 mm2，周围结构指向已校准的8.9 nm台阶；右：水平获取的DHM轮廓测量值作为单个中值轮廓给出，分别对λ1，λ2和均值的h为9.09 ± 1.27 nm，8.20±1.00 nm和8.65±0.83 nm[11]。
