22mer DNA 硫代磷酸酯中的杂质分析

2021-09-29 20:24:18 艾杰尔-飞诺美（Agela & Phenomenex）

治疗性寡核苷酸代表了目前制药行业的新突破。然而，对于寡核苷酸的表征分析来说，使用离子对反相色谱分析（IP-RPLC）是一个十分有挑战的分析方法。寡核苷酸是通过逐步添加核苷酸的固相合成方式被生产出来的。因此，合成中产生的n-1和n+1杂质是必须要被表征出来，而且这表征的需要通过有效的方法开发来得到优化的结果。之后，此优化后的分析方法还可能需要对此寡核苷酸降解后的杂质进行定性和定量。

硫代磷酸酯寡核苷酸的分析代表了一个独特的分析挑战。这些寡核苷酸的特点是用硫基团取代一个或者多个硫酸二酯骨架的非侨联氧。尽管这个修饰能是寡核苷酸更稳定（使其产生：核酸酶抗性）以及提高了寡核苷酸的有效性，但是从分析上讲，其分离和表征会更加困难。硫代磷酸盐修饰后使寡核苷酸出现了立体异构体，由于此修饰细微地改变了寡核苷酸的物理化学性质，在使用常规的离子对反相色谱分析时，可能会导致峰宽变宽。日后，氧化硫代基团的定性和定量是会更为重要，而且这种分离可能会被高度依赖使用。对标准杂质n-1, n-2 的分离是固相合成寡核苷酸生产中必要的工序。此应用，我们通过对 22mer DNA 硫代磷酸酯的色谱分离来表现出此分离结果对后续的质谱表征有多重要。值得注意的是，此应用结果展示出被分离出来的n-1杂质但也可能是我们所谓的PS/PO 氧化变异体。

图1展示了22mer 硫代磷酸酯的分离结果。此紫外色谱图展示在主峰前有两个被提前洗脱下来的杂质，并标示为1号峰和2号峰。图2则凸显出主峰在使用TOF质谱后的全扫描Deconvolution Spectrum (解卷积质谱图)。对于硫代磷酸酯DNA来说，这两个被提前洗脱下来的杂质应该就是n-1和n-2的合成失败序列，但是，他们也有可能是被氧化后的寡核苷酸变异体。

杂质1的Deconvolution Spectrum (解卷积质谱图)（图3a）对此定性为被氧化后的变异体。因此，可能有一些真正的n-1杂质与此变异体被同时洗脱下来形成峰重叠。图3b展示了n-1和n-2杂质。此解卷积质谱图表明了当与主峰质量对比时，一个质量为329Da的delta片段很有可能就是我们的目标序列所缺少的一个鸟苷残基。之后对其他提早洗脱下来的杂质峰可能是其他失败的短序列，但是在对其的质谱定性中由于未能产生足够的光谱信息解卷积未能对其进行表征。

综上所述

此应用，我们展示了bioZen™ 2.6µm Oligo 色谱柱对DNA硫代磷酸酯杂质的分离能力，并使用质谱来对PS/PO和n-1杂质来进行定性。虽然通过对液相方法的优化可以进一步提高对杂质的分离，但是此应用也证明了色谱柱性能在硫代磷酸化后的寡核苷酸杂质分析中的重要性。