2021-09-10 07:49:12, 基泰生物 上海基泰生物科技有限公司
对于色谱工作者而言,面对复杂成分的检测,分离是首要的关注点。无法有效分离意味着无法进行准确的定性、定量检测。无论是何种分离色谱,对于目标成分的分离均有相应要求。以中国药典通则0500色谱法项下的相关描述为例,薄层色谱中要求“除另有规定外,分离度应大于1.0”,高效液相色谱法、离子色谱法及气相色谱法等要求“除另有规定外,待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应不小于1.5”,分子排阻色谱法中要求“除另有规定外,分离度应大于2.0”。本文主要以高效液相色谱法为例,抛砖引玉谈一下系统适用性中“分离度”这个参数,以期对该参数有一个更为深入的思考和认知,其中的案例也希望能给实际工作一些借鉴。
什么是基线分离?
基线分离是每一个色谱分离工作者在兼顾效率前提下的终极追求。理论上,当分离度等于1.5时,即可认为达到了基线分离。为什么是“即可认为”,而不是绝对认为呢?这里面涉及到正态分布/高斯分布,3σ,6σ等概念。这些概念稍显顽固,我们给予记过并留待察看,暂不深入追究。用点色谱参数里常用的名词,再加一点通俗语言来说就是,对称因子为1.0的两个高矮胖瘦一模一样的色谱峰,当分离度为1.5时可认为是基线分离。
但往往我们实际分离时,基本看不到标准分离图,往往相邻色谱峰各有千秋,导致同一个分离度会出现完全不同的分离效果。既然如此,不要死背1.5,要结合实际情况来分离。
很多人都做过仿制药吧,或者改良型新药,甚至创新药!99.9%的核心技术思想离不开模仿、借鉴,还有0.1%留给那些从0到1的“传说”。同样的,我们这个问题,不妨看看别人家的孩子是如何优秀解决的。
下表1列举了从中国药典以及欧洲药典中随机摘录了一些典型的实例,对于分离要求可以说是“五花八门”。当然,这里对于具体品种为何制定了当前的分离要求,以及做了哪些研究,我们暂不做深究,也确实有心无力,无从下手,仅仅从表象来看个热闹。
如果说中国药典中的例子还算中规中矩的拓宽了我们对分离度1.5的认识,那欧洲药典分离度3.3、1.7、1.1是什么操作?这种有零儿有整儿的分离度是怎么搞出来的儿?峰谷比又是什么操作,跟分离度有什么区别,我该怎么选?
既然欧洲药典都可以这么干,那我们能不能也模仿、借鉴一下?
能!且在这个彰显个性,鼓励创新的时代里,建议不要做分离度1.1、3.3这种纯仿制,也不要假模假式的做一些分离度1.2、3.4这种me-too,可以尝试做一些分离度2.2、4.4这种me-better,或者大胆一点做一些分离度1.03、2.21这种四不像。
比如,方法开发及方法验证时实际分离度为1.4,为了日后方法系统适用性通过性的保险起见,怀着一丝的忐忑,带着欧洲药典的一丝安慰,标准制定时写下了1.2,大胆一点的直接来个1.0。
合理吗?有人说之所以定了1.2,是来源于耐用性验证时在某条件下的最差分离度。暂且不去推测该耐用性试验是如何设计的,但我相信大多数情况下对于制定1.2分离度的证明性是不够的。
当然,不仅是达不到分离度1.5时的退让,更有很多达到1.5后的前进,比如分离度应大于10.0。这些数值的制定不仅仅是一个耐用性的探索,更不是冒险或保守之类的估计,而是需要具体的试验设计去验证。
以下提供一个参考实施例,用于说明制定分离度时的考虑。
以“甲磺酸溴隐亭”有关物质分析方法为例,色谱条件如下:
系统适用性要求(下图):杂质A与杂质B分离度应大于1.1。
根据以上信息,我们可以推断的是,实际分离效果肯定不止1.1,这只是一个最低可接受限度。因此在正常色谱条件下对方法进行完整验证后,针对希望拟定的分离度再次进行试验设计以验证合理性。
方法学验证设计(针对分离度或峰谷比制定)简述如下(如有遗漏谬误还请自行脑补修正,朝着目标前进):
1、拟定分析方法耐用性的关键参数:碳酸铵溶液浓度、流速、柱温、色谱柱及仪器。
2、拟定关键耐用性参数在日常检测中可能出现的偏离,比如碳酸铵溶液浓度由于配制过程导致的误差,由于仪器本身性能导致的流速及柱温控制差异,色谱柱批次间的差异,不同仪器(型号、品牌)之间的差异。这些差异均可以根据经验及相关的性能确认(PQ)进行预先估计,在估计的基础上适当放宽考察。
3、在上述各种拟定的偏离条件下进行分离度考察,确定最差分离度,比如说是在流速2.2ml/min时分离度为最差的1.1。
4、在流速2.2ml/min,分离度为1.1的条件下,设计杂质A与杂质B的灵敏度(检测限、定量限),线性与范围,准确度(加标回收)试验。此时,我们甚至可以在该条件下兼顾其他杂质的再次验证。
5、在最差分离度条件下,各项验证均满足拟定的验证要求时(不一定非得完全按照中国药典9101的要求),可以合理的制定所希望的分离度或峰谷比。
此外,尚需说明一点的是,耐用性不是通过性验证,无需拟定范围后追求耐用性试验的通过。耐用性的参数应在方法开发阶段已完成边界的探索,并进行了初步的验证;在方法学验证阶段根据开发时的边界,适当调整符合实际使用场景的参数偏离范围并进一步的确认。
因此,需要根据具体情况,在参数调整后设计不同程度的耐用性验证试验,并没有一个SOP似的参考模板,这是该项验证与其他验证项目最大的不同,也是我们制定非常规要求分离度(比如分离度1.0,10.0,峰谷比5.0等)的基础。
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