学会这个套路，轻松运用m6A发表3-5分文章

随着m6A RNA甲基化的研究越来越热，m6A文章发表得也越来越多，今天小编就给大家带来应用案列，看看大家都是怎么利用m6A轻轻松松的发表3-5分文章的。

研究目的：利用m6A高通量测序探索结直肠癌CRC中的m6A甲基修饰情况

样本信息：6对CRC样本和肿瘤-邻近的正常组织

测序策略：meRIP-seq+RNA-seq

结论：与肿瘤邻近的正常组织相比，CRC样本有1343个失调的m6A峰，625个m6A峰明显上调，718个m6A峰明显下调。具有m6A峰改变的基因在调控葡萄糖代谢、RNA代谢和癌症干细胞方面起着关键作用，调控m6A修饰可能是预测癌症患者生存期和干预未来肿瘤进展的一种替代策略。

对6名CRC患者的肿瘤组织和与肿瘤相邻的正常组织进行了MeRIP-seq分析，与正常组织相比，肿瘤组织有625个明显上调的m6A峰，对应265个基因的转录本，有718个明显下调的m6A峰，对应311个基因的转录本（A）；（B)展示了所有转录本的平均m6A峰的区域的累积分布。(C) 饼图显示正常和肿瘤组织中m6A峰在基因组上的分布。(D) 每个mRNA中改变的m6A峰的分布。(E) 每个基因中改变的m6A峰的分布。(F)每条染色体中改变的m6A峰的分布情况。(G) 从改变的m6A峰中富集的前五个motif。

为了研究CRC中m6A修饰的生物学意义，对差异甲基化的mRNAs进行了GO和KEGG分析。首先对上调和下调的m6A修饰基因进行GO分析，展示了前10个显著富集的GO；在KEGG通路分析中，发现CRC中m6A峰上调的基因与葡萄糖信号通路、钙信号通路和MAPK信号通路显著相关；m6A峰下调的基因与糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、剪接体和RNA转运有明显的关联。

MeRIP-seq和RNA-seq数据（input）的联合分析，Volcano图显示CRC组织中的差异表达基因与邻近正常组织中的差异表达基因的比较。热图显示CRC组织中的差异表达基因与相邻正常组织中的差异表达基因。四象限图显示在m6A修饰和mRNA水平都有明显变化的基因分布；发现297个高甲基化的m6A峰在mRNA明显上调（3；hyper-up）或下调（294；hyper-down），而328个低甲基化的m6A峰在mRNA明显上调（322；hypo-up）或下调（6；hypo-down）。

对m6A修饰有变化同时mRNA的表达有变化的基因（294个），进行了GO和KEGG分析，GO分析表明，这些基因主要富集在典型的Wnt信号通路、焦点粘附和蛋白结合；KEGG通路分析显示，这些基因主要富集在ECM-受体中。

为了评估由m6A修饰调节的基因表达的临床意义，把meRIP-seq，RNA-seq和TCGA的数据做了联合分析，在TCGA数据库中验证了294个m6A调控差异表达的基因。确定了261个不同表达的基因，这些基因普遍出现在我们的研究和TCGA数据库中。通过单变量Cox回归分析，10个候选基因的表达与CRC患者的预后显著相关（P<0.05），其中包括3个保护基因和7个风险基因；结合单变量Cox回归分析（p < 0.05）和对数秩检验（p < 0.05），发现4个基因（WDR72、SPTBN2、MORC2和PARM1）与CRC患者的预后有关。

分析了这四个基因与临床特征之间的关系。发现三个基因（WDR72、SPTBN2、MORC2）在远处转移、淋巴结转移和临床晚期的患者中表达量明显偏高，而PARM1在淋巴结转移和临床晚期的患者中低表达。

研究目的：MeRIP-seq分析创伤性视神经病变（TON）中m6A修饰的改变情况以及m6A修饰的作用

样本信息：假手术组和TON组，3vs3

测序策略：meRIP-seq+RNA-seq

结论：与m6A相关的基因（METTL3、WTAP、FTO和ALKBH5）的表达在TON后都被上调了。总共有2810个m6A峰被不同程度地上调，689个m6A峰被下调。该研究揭示了TON早期m6A修饰的差异表达，为TON的机制和治疗提供新的见解。

TON后12小时大鼠视网膜组织中甲基转移酶和去甲基化酶的mRNA水平，通过Q-PCR检测，结果发现TON后12小时，甲基转移酶（METTL3和WTAP）和去甲基化酶（FTO和ALKBH5）的mRNA水平在视网膜中都明显上调。

通过对大鼠TON后的m6A修饰高通量测序，发现TON后12小时，共有2810个m6A峰被不同程度地上调，而689个m6A峰被下调。这些m6A峰在编码序列CDS区中富集。差异表达的m6A峰可以在所有的染色体上找到，主要是在Chr1、Chr2、Chr3和Chr10上。此外，m6A峰的特征都是以GGACU motif为主，符合m6A的motif特征。

为了研究m6A修饰的病理生理学意义，对m6A修饰有差异的基因进行了GO和KEGG分析。根据GO分析，TON视网膜中上调的峰与蛋白质结合、神经系统发育和细胞内显著相关。下调的峰值主要与未折叠蛋白结合、细胞定位和细胞内部分有关。

KEGG分析显示，上调的m6A峰与MAPK信号通路、NF-κB信号通路和TNF信号通路明显相关；下调的m6A峰与核糖体途径明显相关。

MeRIP-Seq和RNA-Seq联合分析，RNA-seq共检测到520个上调的基因和258个下调的基因。通过层次聚类分析了两组之间差异表达基因的程度，四象限图展示了161个上调的mRNA转录本（hyper- up）和15个下调的转录本（hyper-down）中发现176个高甲基化的m6A峰；在13个上调的mRNA转录本（hypo-up）和50个下调的转录本（hypo-down）中发现63个低甲基化的m6A峰。

研究目的：分析正常排卵妇女和非肥胖的多囊卵巢综合征（PCOS）患者在控制性卵巢过度刺激后的黄体化颗粒细胞（GCs）的m6A甲基化图谱

样本信息：对照组和PCOS患者黄体化颗粒细胞（GCs），3vs3

测序策略：meRIP-seq+RNA-seq

结论：在多囊卵巢综合症患者的黄体化GCs中，m6A水平有所增加， FOXO3 mRNA在多囊卵巢综合症患者的黄素化GC中m6A修饰减少，m6A没有介导FOXO3的转录，但是参与了FOXO3 mRNA的稳定性。

通过比色法检测在卵巢过度刺激后收集的黄体化GCs总RNA（A）和mRNA（B）中的m6A含量，与对照组相比，PCOS患者的黄体化GCs中的总的m6A水平高出两倍，并且RNA的m6A水平在多囊卵巢综合征患者的黄体化GCs中有所增加。

MeRIP-seq来分析GCs中m6A修饰的转录组分布。在对照组和PCOS患者中分别鉴定出2764和3405个m6A峰；根据两组峰的富集倍数分析了不同的峰。对照组和PCOS患者中分别有1719和2195个峰，而两组中都有996个峰重叠；对照组的m6A峰在终止密码子周围强烈富集，PCOS患者的m6A峰在终止密码子周围的富集程度不明显，而在CDS（编码序列）和TSS（转录起始位点）区域的位置有所增加。

对照组和PCOS患者黄体化GC中PCOS相关基因（AMH, AR, FOXO1和FOXO3）的mRNA水平，以及甲基转移酶（METTL3和METTL14）和去甲基化酶（FTO和ALKBH5）的表达情况进行验证。AMH、AR、FOXO1和FOXO3的表达与对照组相比在PCOS患者的黄素化GCs中呈上调趋势，METTL3、METTL14、FTO和ALKBH5在多囊卵巢综合症患者中的表达都有所提高；选择性地敲除了对照组和多囊卵巢综合症患者的黄体细胞中METTL3、METTL14、FTO或ALKBH5的表达，Q-PCR验证对FOXO1、FOXO3和SBK1表达的影响。

通过上面的验证重点关注了甲基化修饰差异的FOXO3这个目标基因，IGV峰图展示了m6A峰在FOXO3转录本3''-UTR上的分布。并且MeRIP-qPCR验证了FOXO3的m6A修饰在m6A target位点上的不同水平。为了确定m6A修饰如何调节FOXO3转录本，分析了m6A峰的序列。在3''-UTR的m6A峰内发现了一个推定的m6A位点，位于位置+2279（相对于翻译起始位置+1）。

由于YTHDF2是导致m6A修饰的mRNA衰变的主要结合蛋白。接下来下调YTHDF2，验证对人类GCs中FOXO3表达的影响。下调YTHDF2增加了FOXO3转录本的数量，和FOXO3总蛋白水平。

m6A目前是一个热点研究方向，所以利用这个技术来发表文章相对容易，从上面的文章套路来看：找准一个研究方向——收集样本meRIP-seq（至少3vs3）——生信分析——简单验证（甚至都不用验证），一篇3-5分的就手到擒来了！