2021-07-29 07:12:46, 赛多利斯 德国赛多利斯集团
最近一则关于也门的渔民捡到一块127公斤龙涎香,卖出后售价高达960万的新闻频上热搜。当大家纷纷惊叹龙涎香的价格堪比黄金的时候,其实,在生物界还有一种远远比黄金贵的多的东西,那就是生物研究中不可或缺的蛋白。比如科研用的很多蛋白售价动辄几千1g是非常常见的,当然也有上万的,可以说比龙涎香或是黄金贵的多了。
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那为什么蛋白那么贵呢?因为蛋白的产量是非常低的,尤其是哺乳动物细胞培养得到的蛋白,一般浓度都是极低的。那么,这么珍贵的蛋白,如何能做到尽量的不浪费呢?比如在细胞澄清后进行浓缩和换液的步骤,都会涉及超滤的步骤,而小伙伴们肯定最担心的就是是否有膜上残留导致浪费蛋白的问题,那么如何提高蛋白的回收率呢?今天,小赛就从如下几个方面谈谈关于蛋白回收的问题。
首先,不同的超滤膜对于不同的蛋白,回收率是有差异的
不同的膜材质(再生纤维素RC, 聚醚砜PES,三醋酸纤维素CTA,Hydrosart膜)会对样品的回收率产生影响,并不是一种膜可以适合所有的样品。因为蛋白样品是一个复杂的体系,在这个体系中每个因素或是多个因素同时变化都会影响到蛋白的回收率。而不同的膜材质也有不同的结构,带电性和疏水基团等影响膜吸附的因素。所以,并不是一种膜孔径的所有膜材质吸附效果都是一样的。因此如果你的pH和盐条件、温度、分子特性等发生变化,就需要重新确认哪种膜才是最适合你的新样品。
其次,超滤孔径选择不合适
关于超滤孔径的选择,很多小伙伴都知道需要1/3法则。即选择目标蛋白1/3的膜孔径的超滤产品。但是,现实生活中,我们的蛋白性质往往并不是理想的球形,同时也有不同的缓冲液影响,所以,有的时候,需要选择比1/3还要小的孔径才能做到尽量多的回收。
小伙伴们,如果你发现你的蛋白经常回收率波动大,或是漏蛋白,那可能要考虑是不是目前这个蛋白需要更小的膜孔径才能得到稳定的回收率。
最后,巧用预处理并控制离心条件也可以增加回收率
因为超滤膜的表面是干燥的,同时,上面会有少量的甘油等作为保湿剂。所以,如果直接用来过滤样品,膜上会吸附一点蛋白样品。这个时候,就需要通过预处理(钝化步骤)来减少蛋白的吸附。
钝化步骤
1 | 先用Arium 水(Arium 水机生产的超纯水或去离子水)清洗,用移液器去除残留水分。 |
2 | 选择下面推荐的其中一种钝化液室温至少2小时或过夜浸泡(除了Triton X-100不推荐过夜): 奶粉 1% BSA 1% Tween 20 5% SDS 5% Triton X-100 5% PEG 3000 5% 加入Arium 水中 加入PBS 中 加入Arium 水中 加入Arium 水中 加入Arium 水中 加入Arium 水中 |
3 | 去除钝化液,用Arium 水冲洗3-4遍。直接使用或4度Arium 水保存。 |
其他浓缩过程中的因素
另外,在浓缩过程中,不均衡的蛋白质、pH/样品缓冲液条件以及高剪切应力也会导致敏感蛋白降解产生,从而影响回收率。蛋白质的形状越呈线性,高离心力对结构的不利影响就越大。如果蛋白质呈线性、延长浓缩时间,降低离心力,则会显著降低蛋白降解的可能。而对于更常见的球状分子,建议使用最接近最小样品量的装置,这样可确保更大的表面积、减少堵塞概率并会增加作用于样品上的离心力。
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