浅析FDA《双特异性抗体开发指导原则》中的动力学表征问题

2021-06-10 14:17:35, 陈老湿德国赛多利斯集团

Octet

双特异性抗体（BsAbs）是同时可以结合两个靶点的抗体药物，可以将效应细胞直接作用于靶向肿瘤细胞，提高抗体的选择性，改善药物的安全性和有效性。与两种单抗混合治疗相比，双特异性抗体可以降低开发和临床成本，是当下抗体药物开发的香馍馍。预测2025年双特异性抗体全球市场规模将达到80亿美元【1】。美国FDA在2021年5月底颁布了最终版的《双特异性抗体研发指导原则》【2】。

下面是此文的CMC quality consideration(生产工艺质量属性研究)部分：

亲和力（affinity）大家都很熟悉了，以前关于生物药物活性的一些指导原则中经常出现。这次双抗指导原则中的on-rate和off-rate是啥东东呢？“打开/关闭速率”？

当然不是，这两个词的正确描述是（双特异性抗体与两个抗原间的）“结合速率”与“解离速率”。

关于检测on-rate和off-rate

两个分子（A和B）的结合实际上是动态可逆的过程。A和B结合的同时，解离也同时发生，所以通常用结合速率与解离速率来表征其相互作用的速率，亦称为动力学表征。

动力学表征参数包括：

	On-rate：结合速率常数, 用kon或者Ka表示。该参数代表配体（A）和分析物（B）之间的结合速率。每1M的A分子和B分子每秒产生的复合物数量，单位为 M-1s-1。
	Off-rate：解离速率常数, 用koff或者Kd表示。该参数反映了复合物（AB）每秒钟发生解离的量的百分比。koff越大，解离越快，单位为s-1。
	KD：平衡解离常数，用KD表示。 KD代表了两个分子相互作用结合能力的强弱，也就是我们通常所说的亲和力（affinity），其数值等于Koff/Kon。

BLI技术是列入美国药典
中的检测动力学方法之一

应用基于BLI技术的Octet分子互作分析系统，能够非标记、实时地检测两个或多个分子间的动力学参数。常规方法如下：先将A分子（配体）固化在传感器上，然后通过和B分子（分析物）的相互结合\\解离这两个步骤来获取这些参数。

第一个步骤是结合，即将固化了A分子的传感器浸入到含有B分子的溶液中进行结合反应，通过特异性结合生成AB复合物。

第二步是将含有AB复合物的传感器浸入到不含B分子的缓冲溶液中进行解离。分析软件将根据实时的结合/解离曲线分析得到kon和koff值。

亲和力（KD）的数值通常用ELISA这些传统技术也能获得。而动力学参数Kon和Koff就只能通过以BLI技术为代表的实时非标记检测技术来进行检测。目前BLI技术已经被美国药典列为动力学表征的互作方法之一，详见15年的等待！BLI技术正式列入《美国药典》（USP-NF）。

on-rate和off-rate的重要性

为什么这次发布的指导原则提出需要提供on-rate和off-rate这两个重要的参数呢？这个就要从BLI技术和传统的ELISA等方法的差别说起。

	ELISA是终点法（End Point）检测，无法获得解离\\结合速率快慢的过程信息，而这些信息往往比单一的亲和力值（KD）更重要；
	BLI技术在偶联配体时，可以避免疏水包被导致的抗原表位丧失；
	BLI技术可以很好的检测nM~pM范围内的亲和力，而且重复性好；
	整个检测过程无需洗涤步骤，特别适合检测解离较快的弱结合。
	Octet自动化，节约大量人工成本，比如Octet RED384和HTX还可以整合机械臂。

在杂交瘤上清中用Octet的传感器固化不同抗体，对同一浓度的抗原进行结合解离的曲线，综合考虑On-rate和off-rate对抗体进行评估

Octet检测双特异抗体案例分享

目前已经有很多篇文章或者专利用Octet检测双抗的亲和力，这里陈老湿就引用NIH（美国国立卫生研究院）的一篇文章以供大家学习【3】。该作者设计了一些HIV的中和抗体，其中一种名为VRC07 X 10E8的双特异抗体可以同时识别CD4和gp41的MPER（近膜结构域）两种抗原，其VRC07针对CD4，而10E8针对MPER。

用AHC（anti-human Fc）传感器固化抗体，检测CD4和MPER，发现双特异抗体的亲和力与母本的一致。

用SA或者AR2G固化CD4，然后依次结合双特异抗体和MPER，发现双特异抗体可以同时和两个抗原结合。

陈老湿曰

另外，这次发布的双抗开发指导原则的CMC quality consideration内容中，还提到需要检测同源二聚体的污染物，Octet对此有专门的应用方案，文末有下载哈！

该指导原则强调了koff和kon动力学检测的重要性。简而言之就是仅仅做亲和力表征已经不够用啦，还要检测on-rate和off-rate这两个动力学参数。不仅对双特异性抗体如此，其他抗体药物也要检测与靶点或者Fc受体的动力学参数。由于传统方法的各种局限性，基于动力学的检测方法也会被越来越多地用于法规要求中。

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Octet检测同源二聚体的污染物的方案

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-参考文献-

[1]https://www.prnewswire.com/news-releases/global-bispecific-antibody-market-to-2025-drug-sales--clinical-pipeline-insights-with-an-8-billion-market-opportunity-300780848.html).

[2]Bispecific Antibody Development Programs Guidance for industry(FDA).

[3] Bispecific Antibodies Targeting Different Epitopes on the HIV-1 Envelope Exhibit Broad and Potent Neutralization. Journal of Virology. (2015). 89:24.