Nature I EGCG介导的α-Synuclein“活性寡聚体”对细胞膜破裂和细胞毒性的保护作用

   科学研究表明(−)-Epigallocatechin gallate (EGCG) 即表没食子儿茶素没食子酸酯，是绿茶茶多酚的主要组成成分，是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗肿瘤作用。

     不仅如此，在最新医学研究中，用帕金森病的病理组分α-突触核蛋白（αS）重新评价绿茶的主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的治疗价值。

      众所周知，帕金森氏病（PD）是仅次于阿尔茨海默氏病的第二大最普遍的神经退行性疾病，其特征是神经内路易体形成和多巴胺能神经元的选择性丧失，从而导致震颤，僵硬，运动迟缓和体位不稳的运动不足表现。 而α-突触核蛋白（αS）被认为是一种病理成分，因为不仅证明了其基因的过表达和点突变与家族性早发性帕金森病有关，而且还发现它是路易小体的主要成分。Jee Eun Yang, Kun Yil Rhoo等学者在2017年发布的研究报告（Yang, J.E., Rhoo, K.Y., Lee, S. et al. EGCG-mediated Protection of the Membrane Disruption and Cytotoxicity Caused by the ‘Active Oligomer’ of α-Synuclein. Sci Rep 7,17945 (2017). https://doi.org/10.1038/s41598-017-18349-z）证实了EGCG不仅通过产生非途径的“紧密”低聚物，而且通过促进“活性”低聚物转化为淀粉样纤维，显示出其对αS介导的细胞毒性的保护作用。

  而在此项研究中， 原子力显微镜(AFM) 负责观察研究了αS的组织结构。将10μL的αS（70μM）在有和无EGCG（350μM）的条件下于37°C摇动条件下（200 rpm）孵育，然后将其加到载有0.1％聚L-赖氨酸的载玻片板上并固定5分钟。 将玻璃板用蒸馏水轻轻冲洗几次，并在真空室中干燥。通过韩国Park Sysems NX10原子显微镜进行了非接触模式下的成像测量。

图1：

（ A ）用TEM（上）和AFM（下）显示在37℃和不加EGCG（350μM）孵育24小时后，αS（70μM）的αS（70μM）的低聚物（黄色箭头）和淀粉样原纤维（红色或白色箭头）。 比例尺代表200 nm。 

（ B ）用尺寸排阻色谱法（Sephacryl S-200）分离低聚物和淀粉样蛋白原纤维。 

（ C ）色谱中存在于15和23级分中的聚集体的TEM图像。 低聚物质的颗粒形式用黑色箭头指示。 比例尺指示0.5μm。 

（ D ）大小排阻色谱法的级分的SDS-PAGE分析。 凝胶用CBB染色。 黑色箭头所示为高分子量蛋白带，显示了抗SDS的αS聚集体。 

（ E ）用TEM和AFM图像跟踪在1∶5摩尔比的EGCG不存在（上）和存在（下）的αS聚集过程。 比例尺代表200 nm。

EGCG生产的两种不同类型的αS低聚物

     基于之前观察，可以考虑EGCG诱导两种类型的αS寡聚体。 一种是偏向CO，它们具有SDS抗性并且不再参与淀粉样蛋白原纤维的形成。 另一个是“瞬态”低聚物，建议对SDS敏感，容易长成淀粉样原纤维 。 事实上，如TEM和AFM所示，在EGCG处理后，αS不仅产生CO，而且还产生淀粉样原纤维（图1A ）。 那些CO和淀粉样原纤维通过Sephacryl S-200大小排阻色谱法从24小时孵育的αS和EGCG混合物中分离出来（图1B ）。 在所有收集到的馏分中，如TEM所示，在馏分编号15和23处达到顶点的两个主峰分别包含淀粉样蛋白原纤维和COs（图1C ）。 此外，SDS-PAGE分析还证实了用EGCG预处理过的两种单独的αS的存在（图1D ）。 由于在第15级馏分的泳道中未观察到蛋白带，因此EGCG诱导的淀粉样原纤维（EGCG-AFs）明显对SDS具有抗性。 另一方面，从馏分23中可以看到几个离散的蛋白带，其中包括单体αS和一些更高分子量的物质。尽管17 kDa单体αS可能是SDS敏感的“瞬态”低聚物的产物，但存在较高的分子诸如43 kDa和75 kDa之类的重量物种是在EGCG处理后形成抗SDS的αS的CO的另一个迹象。 为了阐明COs和EGCG-AF的共存，在不存在和存在EGCG摩尔比为1：5（αS：EGCG）的情况下，通过TEM和AFM追踪αS的原纤化动力学（图1E和补充信息图S3 ）。 根据长时间孵育96小时后获得的TEM和AFM图像，显示EGCG可将αS转化为CO和EGCG-AF的两个单独的库，而单独的αS会产生淀粉样原纤维作为排他性产物（图1E ）。 它们的共存从48小时开始变得明显，并一直持续到孵育结束（图1E ）。 实际上，在孵育的最初24小时内，EGCG-AF实际上出现得更早，而在没有EGCG的情况下，αS本身仅产生寡聚体（补充信息图S3 ）。 这些数据清楚地表明，在存在EGCG的情况下，αS已被转化为CO和淀粉样原纤维的两个独立库。