Nature子刊 | 多组学揭示新生儿的初始微生物群和肠道代谢

表1 

宏基因组测序结果显示大肠杆菌、粪肠球菌和寻常型拟杆菌是检测到的最常见细菌（图1a）。胎粪样品中人类DNA的比例是双峰分布的（高斯混合模型，P <0.001），其中一些样品的人类DNA含量> 80％，另一些样品的人类DNA含量<50％（图1b）。出生后16小时内收集的胎粪样品中含有高水平的人类DNA。我们确定16 h构成一个断裂点（图1c），即分娩后16小时内收集到的粪便的测序表明，人类DNA水平高，而微生物DNA水平低。

Fig.1 | 胎粪样品中的细菌和人类DNA

为了将胎粪大肠杆菌菌株置于所有大肠杆菌基因组的更大背景下，我们将装配体与一组269个参考基因组进行了比较（图2a）。来自胎粪的大肠杆菌基因组广泛分布在发育树上的组A，B1，B2和D1中（图2b），并将大肠杆菌基因组分为三类（图2c）。来自胎粪的基因组属于每个组，相对于参考基因组，少数具有未分配功能的基因在胎粪样品的基因组中更为普遍（图2d）。我们没有在粪便中鉴定出大肠杆菌菌株的强大基因组特征，这表明许多菌株可以作为新生儿肠道的先驱者。 

Fig. 2 | 从胎粪样品中组装大肠杆菌元基因组

细菌菌株的数量随出生后的时间而增加（P <0.001；图3a），估计每天积累1.2菌株（测定系数，R 2 = 0.46）。除了大肠杆菌，粪肠球菌和寻常型芽孢杆菌外，检测到的最早的物种是来自肠杆菌科和芽孢杆菌的兼性厌氧菌，如链球菌和肠杆菌（图3b）。出生后25小时检测到专性厌氧菌，包括厌食芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌，巨球藻和韦永氏菌。仅在出生后>100 h收集的样品中发现了双歧杆菌。通过16S qPCR分析，发现菌株数目与细菌DNA绝对量呈正相关性（Spearmanρ= 0.7，P <0.001）；图 3c）。对于大肠杆菌，从1个月时间点开始的17个样品中有9个与出生样品中组装的确切基因序列的存在一致（图3d）。从出生到1个月的细菌菌株保留率与大约50％的潜在发生率相一致，而寻常型芽孢杆菌的保留率最高。

Fig. 3 | 1月大婴儿的胎粪中的细菌菌株及其保留

根据包含人类、大肠杆菌、寻常型芽孢杆菌和粪肠球菌蛋白质序列的参考数据库，我们鉴定了1,071个人类蛋白质和163个细菌蛋白质。细菌蛋白的相对丰度很小，平均值为0.6％，但随着出生后小时数的增加而增加（P = 0.01），并且通过qPCR产生的细菌与人的DNA的比率相对增加（P = 0.01；图4a）。对人类蛋白质丰度的主成分分析显示，人类DNA含量较低的16小时后收集的样品与其他样品之间存在差异（P <0.001；图4b）。进一步分析确定了53种人类蛋白质，这些蛋白质在16h之前收集的胎粪中比16h之后在人类DNA水平较低的情况下收集的丰富（图4c）。基于已知的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析（图4d），发现通过检测微生物而减少的大量蛋白质被连接到三个节点：SERPINA3，细胞分裂周期42（CDC42）和纤连蛋白1（FN1）。GTP结合蛋白CDC42在肠上皮的完整性中发挥关键作用，FN1是在肠的上皮基底膜和结缔组织基质35中发现的粘附糖蛋白。上皮相关蛋白的减少可能是由于胎儿肠道发育期间在子宫内清除了积累的蛋白质所致。

Fig. 4 | 胎粪样品的蛋白质组学

我们调查了胎粪中的小分子，发现人类DNA含量高的样品具有相似的代谢产物谱。在具有微生物定植和低水平人类DNA的样品中，有45种代谢产物差异丰富（图5a）。我们通过计算确定了厌氧条件下7种底物的最大ATP产量，并列出了在代谢组学结果中发现的18种分子产物的量（图5b）。为了进一步分析观察到的混合氨基酸发酵，我们使用营养通量模型确定了乙酸盐与琥珀酸盐生产的不同比例下的ATP产量（图5c）。接下来，我们试图进一步探索在受控条件下氨基酸代谢和乙酸/琥珀酸生产的预测模式。我们在Luria-Bertani肉汤中培养了大肠杆菌，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/ MS）依次测量了培养基中的氨基酸水平，结果显示大肠杆菌优先利用氨基酸，其中丝氨酸在厌氧条件下显示出最大程度的消耗，如通过1H核磁共振（NMR）测得的乙酸盐生成量（图5d）。苏氨酸的含量也随着粪便中细菌的检测而降低（图5a）。相比之下，在有氧条件下，氨基酸的消耗要复杂得多，首先是丝氨酸，然后是许多其他氨基酸（图5e），这与以前在最少培养基中进行的实验结果一致。

Fig. 5 | 胎粪样品的代谢组学和大肠杆菌氨基酸的使用

研究结论

本实验基于蛋白+微生物+代谢组学联合分析，研究了88名非裔美国人新生儿的粪便样本，发现三种最早的物种即大肠杆菌，粪肠球菌和寻常型拟杆菌及新生儿肠道菌落的基因组特征。此外，细菌的出现与大约50种人类蛋白质的丰度降低、游离氨基酸水平降低以及细菌发酵产物（包括乙酸盐和琥珀酸盐）的增加有关。通过流量平衡模型和体外实验，证明了氨基酸的发酵为厌氧条件下大肠杆菌（最常见的早期定居者）的初始生长提供了一种机制。这些结果提供了人类肠道中第一种微生物的深入表征，并显示了其外观如何改变生化环境。

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