同样是单细胞测序，同样是熟悉的肝癌，且看大牛是怎么发顶刊《cell》的？

2021-02-22 11:19:58, Dr.WQL 上海吉凯基因医学科技股份有限公司

今天为大家分享一篇近期发表于《CELL》上的文章。作者通过单细胞测序，对原发及早期复发肝细胞癌及癌旁组织中免疫/非免疫组分的详细分析和研究，对肝癌的诊疗提供了深入可信的研究结果。

肝癌是全球第四大致死癌种。肝细胞癌（HCC）是肝癌的主要癌种，占总病例数的75%-85%。手术切除是对HCC具备治愈潜力的最有效疗法，然而，术后复发是阻止生存率进一步提升的关键因素。术后5年内，约50-70%的患者复发，且其中70%的患者是在2年内复发的。快速复发的HCC患者往往较难治愈且预后较差。本文期望通过单细胞测序对快速复发的HCC的瘤内细胞组成进行研究，以指导针对快速复发HCC患者选择更有效的疗法。

作者收集了12例原发性肝癌和6例快速复发肝癌患者的肿瘤及其配对的邻近非肿瘤的手术样本，组成发现队列（discovery cohort）。作者对发现队列的全部样本进行了全外显子测序，并将组织中免疫细胞（CD45+）和非免疫细胞（CD45-）进行流式细胞术分选（FACS）分选后，分别进行单细胞测序和生信分析，见下图A。原发性肝癌肿瘤和配对邻近非肿瘤组织分别称为PT和原发性非肿瘤（PNT），而早期复发肝癌的肿瘤和配对邻近、非肿瘤组织分别称为RT和复发非肿瘤（RNT）。

此外，作者还招募了4名额外的具有配对癌和癌旁组织的PT和早期RT患者进行单细胞测序，以对单细胞测序样本进行验证确认（validation cohort 1）。另外又招募了47名具有配对癌和癌旁组织的PT和早期RT患者，对发现队列进行IHC和RNA-seq测序验证（validation vohort 2）。

通过marker基因对单细胞测序结果进行t-SNE细胞类型归类，作者发现了24个不同的细胞簇（如下图C），其中非免疫细胞主要由内皮细胞（ECs；PECAM1和CDH5）、肝星状细胞（HSCs；ACTA2和PDGFRB）、正常上皮细胞（EPCAM和KRT19）和肝癌恶性细胞（下图D）组成。在大多数患者中，ECS和HSCs的比例很低（小于总非免疫细胞的5%）（下图E和F）。与以前的报告一致，不同患者的恶性细胞是相互分离的。

鉴定到的免疫细胞包括髓源性细胞（LYZ和C1QB）、T细胞（CD3D/G）、B细胞（MS4A1和CD79A）、浆细胞（IGLL1和MZB1）和自然杀伤细胞（NK；KLRF1和KLRD1）（下图C、D）。所有这些细胞亚型在患者之间以及PT和RT样本之间共享，尽管比例不同（下图E和F）。所有患者的B细胞、浆细胞样DCs（pDCs）和浆细胞浸润水平均较低。其他免疫细胞簇在患者中各不相同，揭示了肝癌肿瘤免疫细胞组成的异质性（下图F）。但是，尽管存在这种变异性，RT和PT样本具有相同的主要免疫细胞亚型和相似比例的淋巴样和髓样衍生细胞。

作者接下来对髓系细胞和T细胞/NKs进行了无监督聚类。髓系内共出现11个簇，包括巨噬细胞的5个簇（Macro1-Macro5），2个单核细胞（Mono1和Mono2）簇，三个DC细胞簇（DC1-DC3）和一个主动循环细胞（下图A-C）。巨噬细胞通过高表达水平的CD163和CD68鉴定。集群Macro2-Macro5显示患者个体间差异，与以前的报告一致，表明每个肿瘤的不同微环境有助于该人群的异质性（下图B）。总DCs在患者中表现出差异，从占总免疫分数的0.1%-20%不等。这一比例在RT中高于PT样本，在RNT中高于PNT样本（下图D）。在验证组2，双色IHC染色，也证实DCs在RT组丰度增加（下图E）。

接下来，作者探讨了HCC浸润CD8+细胞的动态免疫状态和细胞转变轨迹，通过整合TCR克隆信息和细胞转变轨迹，这一转变轨迹被确定为启动于CD8 CCR6和CD8 NR4A1细胞，通过以CD8 GZMH和CD8 GZMK为特征的具备细胞杀伤能力的中间状态，最终达到一个以CD8 CLTA4和CD8XCL1为特征的耗尽状态。

根据不同细胞类型间的TCR克隆扩增，作者观察到CD8 XCL1与CD8 CLTA4相比，CD8 XCL1细胞具有更多的具有细胞毒性的亚型（CD8 GZMH和CD8 GZMK）。此外，CD8 XCL1细胞比CD8 CLTA4细胞表现出更低水平的耗尽水平，表明这些细胞代表了早期耗尽状态。作者确认耗尽水平上调，而细胞杀伤毒性水平，尽管最初有所增加，但在后续转变过程中下调（下图B）。

之后，作者分别分析了在PT和RT患者样本中T细胞的转变轨迹，惊讶的发现，处于早期启动状态的CD8+ T细胞主要分布于RT样本，而几乎没有细胞处于终末状态，与之形成鲜明对比的是，在PT样本中CD8+ T细胞主要位于终末端的细胞毒性和耗尽状态（下图C）。之后作者研究了与状态变化相关的转录变化，并观察到CD8+ T细胞簇可分为4个阶段（下图D）。CD8 CCR6和CD8 NR4A1细胞主要为第1期，其特征是CCR6，CCR7，NCR3、KLRB1的表达上调，GZMA、GZMB和GZMH的表达下调，这表明这些细胞具备最低的细胞毒性（下图D）。通路分析表明脂质代谢的信号通路和TGF-b受体信号通路在第1阶段是富集的（下图D）。能量代谢通路分析表明，第1期细胞在脂肪生成，糖酵解、谷氨酰胺代谢和三羧酸（TCA）循环和脂解方面具有较高的表达水平（下图E）。代谢分析表明第1期细胞的功能依赖于脂肪酸氧化和有氧糖酵解，而不是氧化磷酸化（OXPHO）。这个结果表明，第1期细胞与经典的原初（naive）细胞不同，而与记忆细胞更密切相关。对CD45的选择性剪接分析表明，这些细胞更倾向于为CD45RO而不是CD45RA，表明它们有之前已启动而非真正的原初细胞。对这些细胞中转录因子（TFs）的分析显示FOXP1、KLF10、DNAJC2、BCL11B、ELK3和NFKB1的明显上调（下图F）。FOXP1抑制CD8+细胞增殖和GZMB表达，抑制T细胞的抗肿瘤效应功能。FOXP1也介导TGF-诱导的c-JUN转录抑制，在记忆T细胞中具有维持生存的功能。KLF10具有抑制CD8+T细胞激活的作用。阶段2的细胞具有高水平表达的JUN、FOS、NR4A1和NR4A3，肝脏驻留记忆细胞的表型相匹配（下图D、F）。第3阶段的特点是经典细胞毒性基因（GZMH、GZMB、GZMA和GNLY）的表达水平增加，T细胞衰竭标记物（PDCD1、CTLA4和HAVCR2）表达较低（下图D、G）。通路分析表明，3期细胞依赖于脂肪酸代谢，与效应细胞表型一致。第4阶段的特点是高水平的T细胞衰竭相关TFs，包括EOMES、TOX、TOX2、HOPXARNT、ETV1和IRF8，以及参与程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）和有丝分裂途径的基因，进一步证实了这些细胞的耗竭状态（下图D-F）。有趣的是，检查点分子PDCD1和LAYN在细胞毒性（第3阶段）和耗尽状态（第4阶段）之间的转变中仅略有上调，而CTLA4和HAVCR2的表达增加了10倍（下图G）。仅在PT中观察到BTLA的表达升高，而LAG3和TIGIT的表达从失活状态逐渐增加到耗竭状态（下图G）。这些结果表明，在CD8+的转化过程中，免疫检查点的表达是异质性的（下图G）。

相比之下，在PT中，CD8+的T细胞主要特征为第3和第4阶段，代表从细胞毒性到耗尽状态的转变过程（下图H）。尽管RT和PT样品显示了类似的3期细胞比例，但它们陷入了不同的细胞毒性细胞簇，主要以CD8 GZMH为主的RT样本细胞和以CD8 GZMK细胞为主的PT样本（下图H）。作者的结论是CD8+T细胞在PT和RT样本中显示出来了相同的过渡轨迹，但显示不同的免疫和转录状态，提示原发性和复发性肝癌的治疗应考虑不同的免疫治疗策略。

为了进一步研究在RT样本中CD8+的独特转录状态，作者检测了组织驻留、细胞毒性、共同刺激和耗尽相关的基因表达（下图A）。并对RT组和PT组两者之间表达差异最大的基因进行了研究（下图B），表明CD8+ T细胞在RT上调KLRB1（CD161）和IL7R，表现为先天样记忆T细胞表型。IPA分析显示CD8+在RT中为下调ox40的耗竭T细胞信号通路，表明这些细胞处于激活较少但未耗尽的状态（下图C）。通过在验证队列2中进行双色IHC染色试验，作者验证了CD8+CD161+在RT中富集（中位数：33.3%对16.7%，下图D和E）。为了进一步评估这些细胞的效应功能，作者分离了肿瘤浸润的CD8+CD161+和CD8+CD161–T细胞并通过流式检验了颗粒酶B（GZMB）的表达水平。CD8+ CD161+ T细胞表现出较低的GZMB丰度，与较弱的细胞毒性一致（下图F和G）。此外，作者还发现富集的CD161+ CD8+与较高的第二复发率显著相关（下图H；n=47，p<0.05）。综上，在RT样本中包含以KLRB1高表达为特征的CD8+ T细胞，其表现为具有较低的细胞毒性和免疫抑制状态，与在PT样本中发现的耗竭状态不同。并且该细胞群体在PT和RT患者中的含量与较差的预后和肿瘤进展均正相关。

接着，作者研究了在两种患者中CD8+ T细胞的克隆形成能力。作者发现在RT组很少CD8+细胞在扩增（下图A）。在RT和RNT中CD8+ T克隆的相对比例并未发生变化，而在PT组中相对PNT这一比例明显增高（下图B）。通过TCR测序，作者进一步确定，在PT中前10名的CD8+细胞相对PNT明显上升，而在RT组中并未变化（下图C）。这表明在RT样本中，T细胞并未扩增。在来源于P34的成对样本中，在RT中与PT种共享67%的CD8+ T细胞克隆（下图D），其中大部分克隆都识别类似的抗原，表明在PT到RT的过程中，并未发生克隆扩增。进一步的基因表达谱分析表明在RT样本中不能被激活的丧失功能的未激活的CD8+ T细胞来源于PT样本，暗示这些细胞可能为中央记忆细胞（下图E）。在RT中的少量可扩增T细胞仅为PT中的极少数克隆。另外，作者同时发现，原发肿瘤中的至少一个主要突变在早期RT样本中消失了。这些证据共同表明，在RT组中，CD8+ T细胞处于低增殖无应答状态，这一状态是由于肿瘤选择——原代肿瘤中的主要突变在复发时缺失，而先前驻留瘤内的免疫细胞对其他突变没有应答能力。

作者之前的分析表明RT与瘤内Tregs、巨噬细胞和其他免疫细胞组分的降低有关。经过DEG分析，作者发现在PT中细胞周期相关通路的上调表达，而在RT中主要为免疫应答通路（下图A）。在验证队列1中也发现在PT样本中有更高的增殖信号，更低的肝功能信号，而RT中有更高的免疫生存信号和逃逸信号（下图B）。在免疫逃逸相关基因中，作者发现在RT组中更高的CD47表达，表明对巨噬细胞、DC细胞成熟和抗原呈递的抑制。类似的，作者在RT中发现了HLA/B/C的高表达，暗示对NK介导的细胞凋亡的抵抗（下图C）。

在免疫检查点方面，作者发现相对PT组，RT组的细胞有明显上调表达的CD274（PD-L1）的表达和略微上升的CTLA4的表达（下图D）。类似的，在RT组中观察到更高比例的CD274+的细胞，而在RT和PT组中存在类似含量的CTLA4+的肿瘤细胞（下图E）。通过受体配体分析（Ligand-receptor，L-R）分析，作者发现肿瘤细胞和DC2/DC3细胞的交互，在RT中通过CD274/CD80及CTLA4/CD80，而在PT中并非如此（下图F）。通过免疫荧光染色发现，CD80+CD1C+ DC细胞在PD-L1+复发肿瘤细胞附近（下图G）。这些数据综合表明了RT中肿瘤细胞对免疫细胞的抑制剂免疫逃逸能力的形成。

本文就HCC及早期复发的HCC的肿瘤内细胞组成、变化及相互作用，通过单细胞测序及深入的生信分析，进行了多角度的重复揭示，主要涉及肿瘤和免疫细胞各自的表型和差异、T细胞发展分化、TCR的克隆形成及肿瘤和免疫细胞的相互作用。这一文章不仅为肿瘤复发提供了全面可复制的研究模式，并且也为减少复发的更精准诊疗疗方案的选择提供了模板。