Cell: 单细胞测序告诉你人体的血管内皮细胞有多少种类？

内皮细胞（Endothelial Cells，ECs）形成血管的内壁，通常指衬于心、血管和淋巴管内表面的单层扁平上皮。内皮细胞可以吞噬异物、细菌、坏死和衰老的组织，还参与机体免疫活动功能。附着于同一组织不同血管中的内皮细胞是否存在表型差异?不同组织的特定血管类型中ECs是否存在异质性？如何利用单细胞测序解开这个谜底？

目前已有一些团队使用单细胞测序研究血管内皮细胞的异质性，但仅限于同一组织的内皮细胞研究 (Baryawno et al., 2019; Lukowski et al., 2019）。虽然人体有多少种血管内皮细胞由于样本的原因很难获得，但是通过小鼠模型我们可以大概了解有机体的血管内皮细胞种类的全貌。2020年2月发表于《cell》杂志的文章针对小鼠11个不同组织的单细胞RNA-seq研究，让我们对组织内不同血管内皮细胞的整体情况形成比较全面的认识。

根据平滑肌细胞（Acta2）、成纤维细胞（Col1a1）、红细胞（Hba-a1、Hba-a2、Hbb-bs）的表面标志物排除非内皮细胞基质细胞，根据血管ECs标志物排除淋巴管ECs，筛选小鼠11个组织血管ECs。采用t-分布邻域嵌入（t-SNE）算法做单细胞测序数据的可视化分析。

图1. 11种不同组织内皮细胞的提取、纯化流程及数据处理

不同组织中ECs的标志基因表达的热图显示，ECs细胞在不同组织中存在异质性。

图2. 不同组织ECs中top-10标志基因的热图

这些最显著的标志基因中，有些仅在单一组织的ECs表达，有的则表达于2种及2种以上的组织ECs中。那么，具有相同特征基因表达的ECs细胞是否具有相似的表型？

图3. 组织内特异性的ECs标志基因富集分析

615个血管相关基因集差异分析（GSVA）以解释组织分类ECs的现象。

top-10高表达基因集的功能富集分析，揭示来源于不同组织的血管ECs参与不同的生物学过程。由于转录因子及转录调节子在基因表达调控中扮演着主要的角色，转录因子、转录调节子的差异分析显示，不同组织的血管ECs存在异质性。

图4. 不同组织top-10基因集功能富集分析

作者基于ECs表达谱的亚聚类方法研究各个组织ECs的异质性，t-SNE图提供了组织特异性ECs中每个EC子簇的细胞数量和相对分数(%)。最终，作者将小鼠所有组织ECs分为78个亚群。

图5. 组织内血管ECs的t-SNE图

拟时序分析ECs亚群的分化轨迹：是从动脉——毛细血管——静脉的分化过程。

图6. 拟时序分析

组织中究竟有多少种血管？下图展示了各个组织不同血管类型中ECs细胞占比，是基于图5的统计结果：

图7. 组织中的血管类型

由于动脉、静脉、毛细血管、淋巴管4种血管的占比最大。接着，研究人员采用一种新的评价方法探索不同类型血管（动脉、静脉、毛细血管、淋巴管）中ECs的特异性与相似性。

图8. 不同类型血管ECs的特异性与相似性

综上，单细胞表达谱数据揭示不同表型血管ECs存在保守的、组织特异性的基因表达。

由于代谢是调节脉管系统稳态和生长的关键因素，接下来作者想单独分析不同组织中ECs代谢表达谱。1180个ECs代谢相关基因的测序结果发现，不同的代谢通路具有一定的组织特异性。

图9. ECs代谢相关基因的异质性

本文所构建的小鼠正常ECs单细胞分类图谱有助于其他数据集ECs表型的识别（如下图），据此，我们期望可以通过单细胞RNA-seq的方法做不同组织中ECs更加细致的分型，可能有助于识别癌症、眼科疾病等病理性血管新生过程中的病变ECs；有利于ECs参与疾病的发病机制的深入理解；为还未阐明机制的脉管系统疾病开拓了新思路、新方向。

图10. 利用ECs单细胞分类图谱鉴别其他数据集ECs表型

【参考文献】

1.Baryawno, N., et al. (2019). A Cellular Taxonomy of the Bone Marrow Stroma in Homeostasis and Leukemia. Cell 177, 1915–1932.e16.

2.Kalucka J et al. (2020). Single-Cell Transcriptome Atlas of Murine Endothelial Cells. Cell 180(4):764-779.e20.

3.Lukowski, S.W., et al. (2019). Single-Cell Transcriptional Profiling of Aortic Endothelium Identifies a Hierarchy from Endovascular Progenitors to Differentiated Cells. Cell Rep. 27, 2748–2758.e3.