选择最好的荧光蛋白——Light Up Your Research

绿色荧光蛋白于1962年首次在Aequorea victoria（一种随北美西海岸洋流漂移的水母）中被观察到。之后，它就成为当代生物科学最重要的工具之一。在GFP的帮助下，研究人员已经发展出多种方法来观察先前不可见的过程，比如：大脑神经细胞的发育以及癌细胞如何进行扩散等。

2008年，三位美国科学家：美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger Y. Tsien因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得诺贝尔化学奖。

有关荧光蛋白的新应用、新技术也在不断发现，比如最近发表于Cell 的“Multi-color Single-Molecule Imaging Uncovers Extensive Heterogeneity in mRNA Decoding” 中提到的新技术-MoonTag。

1. Localization：可以放在目的基因的N端，也可以放在目的基因的C端。这样的构建方式可以帮助我们观察到目的基因什么时候开始表达以及在哪里表达；

2. Transcription reporter：将荧光蛋白放在待研究启动子的后面，可以很好地观察或者验证该启动子在特定细胞中的启动活性；

3. FRET(Förster Resonance Energy Transfer):用来研究两个不同的蛋白或者一个蛋白的两个不同结构域之间的相互作用关系。通常是使用激发/发射光谱有重叠的两个荧光蛋白。目前蛋白-蛋白相互作用研究中最广泛应用的FRET对就是青色荧光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）；

4. Split EGFP：FRET的另一种实现方法，同样被用来研究蛋白与蛋白的相互作用。具体是将EGFP分割成两部分，分别融合到两个蛋白，当两个蛋白靠近时，EGFP的两部分蛋白开始折叠，成熟到发光；

5. Biosensors：用来监测细胞内小生物分子或其他生理过程，比如AAV载体中的钙指示剂；

6. Optogenetics：是研究人员使用一种新的光控方法选择并打开了某种生物的一类细胞。光遗传技术是21世纪神经科学领域最引人注目的革新，其主要原理是首先采用基因操作技术将光感基因（如ChR2，eBR，NaHR3.0，Arch或OptoXR等）转入到神经系统中特定类型的细胞中进行特殊离子通道或GPCR的表达。光感离子通道在不同波长的光照刺激下会分别对阳离子或者阴离子的通过产生选择性，从而造成细胞膜两边的膜电位发生变化，达到对细胞选择性兴奋或者抑制的目的；

7. Chemogenetics：利用遗传学原理，以化学小分子为工具解决生物的问题，或通过干扰、调节正常生理过程了解蛋白质的功能；

8. In Vivo Imaging：活体成像系统成像原理包括生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶基因标记DNA，利用其产生的蛋白酶与相应底物发生生化反应产生生物体内的光信号;而荧光技术则采用荧光报告基因(GFP、RFP)或荧光染料(包括荧光量子点)等新型纳米标记材料进行标记，利用报告基因产生的生物发光、荧光蛋白质或染料产生的荧光就可以形成体内的生物光源。前者是动物体内的自发荧光，不需要激发光源，而后者则需要外界激发光源的激发；

9. Cell marking/selection：大家做细胞实验，通常都喜欢质粒带有荧光标签比如GFP，有了荧光标签可以很方便的判断质粒的转染效率。这种情况通常是荧光蛋白由另外一个不同的启动子控制或者由与目的基因相同的启动子控制但是通过IRES连接；

10. FACS：流式细胞分选技术，可以方便分选出带有荧光蛋白的细胞，分选出的细胞可以进行培养或其它处理，做更深入的研究。

了解荧光蛋白的应用后，大家是不是都想在以后的实验中使用荧光蛋白？但是，太多种荧光蛋白被发现，被改造出来，那具体如何选择最合适的荧光蛋白进行实验呢？

Rainbow of fluorescent proteins [Tsien lab]

1. 激发波长/发射波长：每一种荧光蛋白都有其独特的激发波长和发射波长，因此，选择的荧光蛋白必须是使用的系统能够激发和检测到的。比如，使用的显微镜只有两个激发器，488 nm和561 nm，那就不能够选择远红外荧光蛋白。又比如，使用超过一个荧光蛋白时，必须确保他们的发射波长没有重叠。

2. 寡聚反应：第一代荧光蛋白易于寡聚化，当和目的基因融合表达时，可能会影响目的基因蛋白的生物学功能。因此建议使用单体的荧光蛋白，比如mCherry。

3. 氧气：许多荧光蛋白的成熟需要氧气，特别是衍生自GFP的荧光蛋白，如果这些荧光蛋白处于缺氧环境，可能就观察不到荧光。

4. 成熟时间：成熟时间是荧光蛋白正确折叠和产生发色团所需的时间。时间可能是几分钟到几小时，superfolder GFP (sfGFP) 和mNeonGFP在37 °C所需时间小于10min；mCherry 大概需要15 min；TagRFP 大概需要100 min；DsRed 大概需要10 hours。

5. 温度：温度会影响荧光蛋白的成熟时间和荧光强度，比如EGFP适合37 °C，所以EGFP最适合哺乳动物或者细菌的研究，而GFPS65T相对适合酵母的研究。

6. 亮度：荧光蛋白的亮度值由消光系数与量子产率的乘积计算得出。在许多情况下，将荧光蛋白的亮度与EGFP(设定为1)进行比较，有一些荧光蛋白非常暗淡（例如TagRFP657，其具有亮度只有0.1），因此亮度也需要考虑。

7. 耐光性：长时间暴露在激发光下，荧光分子被漂白（即失去发光能力）。光稳定性可短至100毫秒（如EBFP）或长达1小时（如mAmetrine1.2）。但是，对于大多数荧光蛋白来说，它只需几秒钟到几分钟。另外，光稳定性可能也会受实验参数影响，例如激发光强度，pH或温度等。

8. pH稳定性：如果计划在酸性环境中表达荧光蛋白，则此参数非常重要，一些荧光蛋白具有不同的ex/em光谱（例如mKeima）或在pH变化时荧光强度会发生改变（例如pHluorin，pHTomato）。

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过表达(GV492)：Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin

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干扰(GV493)：hU6-MCS-CBh-gcGFP-IRES-puromycin

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看完文章，学会怎么挑选荧光蛋白进行实验了吗？还不会！没关系，这里为你挑选了强荧光、高表达的两个载体，选最强的载体，做最“闪亮”的实验。