Cell Host & Microbe | 石胆酸通过重塑肠肝轴改善减肥手术后糖尿病

为了确定菌群是否参与CA7S的产生，对抗生素处理或未处理的饮食诱发的肥胖（DIO）小鼠进行了SG或假手术。术后6周对小鼠实施安乐死以测量术后早期变化（图1A）。采用UPLC-MS对组织中的BA水平进行定量分析。与之前研究结果一致，SG术后小鼠盲肠内容物中CA7S水平高于对照组（图1B）。但是，在术前用抗生素处理小鼠可消除SG介导的CA7S水平升高（图1C）。而且，与未处理组相比，在抗生素处理组CA7S的总体水平显著降低（图1B和1C）。由此推测，菌群是CA7S产生所必需的。进一步分析DIO小鼠、抗生素处理的DIO小鼠或无菌（GF）DIO小鼠CA7S水平，结果发现，抗生素处理组和GF组小鼠肠道中CA7S水平比对照组低100至200倍（图1D）。在抗生素组和GF组小鼠肝脏中未检测到CA7S（图1E）。这些结果表明，菌群是产生CA7S所必需的。

与之前研究一致，DIO小鼠SG术后GLP-1水平增加（图1F）。而且，在SG之前和之后对DIO小鼠进行用抗生素处理均可消除SG介导的GLP-1分泌增加（图1G）。该结果表明，GLP-1分泌也需要菌群。

菌群分离与相关胆汁酸（CA、CA7S、TCA7S）共培养实验结果显示，菌群不直接参与CA7S的生成。已报道，BA磺化主要通过肝脏中BA磺基转移酶发生（小鼠肝脏mSULT2A1、mSULT2A2、mSULT2A8，人体hSULT2A，图1H）。结果显示，与假手术组相比，SG术后小鼠肝脏mSult2A1表达显著升高，mSult2A2或mSult2A8表达没有差异（图1I）。因此，SG术后小鼠肝脏中mSult2A1表达的增加促进CA7S的产生。与DIO小鼠相比，抗生素处理组和GF组小鼠肝脏中，mSult2A1表达水平显著降低（图1J）。这些结果表明，肝脏中mSULT2A1需要菌群才能促进CA7S产生。

BA通过肠肝循环严格调控自身合成和磺化反应。基于CA7S产生需要菌群参与，因此需要探究经细菌修饰的BAs通过门静脉运输到肝脏是否参与CA7S生成。对假手术和SG手术前接受和未接受抗生素处理的小鼠的门静脉进行了BA分析（图2A）。SG术后小鼠门静脉中的总BA水平与对照组均无显著差异（图2B和2C）。

为了测试SG术后门静脉BAs是否可以诱导BA磺基转移酶的表达以及这种诱导是否依赖于菌群，于是模拟经抗生素处理和未经抗生素处理的假手术门静脉和SG门静脉中观察到胆汁酸水平建立体外BAs池，并测试这些重组BA池是否诱导人肝HepG2细胞中hSULT2A表达。结果发现，与假手术门静脉 BA池相比，SG组在体外显著诱导hSULT2A表达。而且，假手术情况下，与未经抗生素处理组相比，将细胞与抗生素处理的门静脉 BAs孵育时，hSULT2A表达显著降低（图2D–2F）。而且，在抗生素处理后，与假手术小鼠相比，SG小鼠的BA池中hSULT2A表达无差异（图2E）。这些结果表明，SG术后，门静脉BA可以诱导肝细胞hSULT2A表达，并且这种诱导存在菌群依赖性。

在假手术组和SG组小鼠门静脉中存在四种差异BAs，即去氧胆酸（CDCA）、牛磺脱氧胆酸（TDCA）、CA和LCA，经抗生素处理后，门静脉四种胆汁酸水平无差异（图2B和2C）。为了确定这些BA中的哪个可以诱导mSult2A1 / hSULT2A表达，分别测试四个胆汁酸在HepG2细胞中诱导hSULT2A表达的能力。其中，LCA诱导的hSULT2A表达呈剂量依赖性，而CDCA，TDCA和CA在所有测试浓度下均未诱导hSULT2A表达（图3A）。LCA是菌群衍生的次级BA。因此，再次验证mSult2A1表达需要菌群参与。此外，与假手术小鼠相比，LCA是在SG术后门静脉中唯一显著增加的BA（图2B）。由此表明，SG术后，菌群代谢物LCA通过门静脉运输到肝脏，并诱导肝mSult2A1的表达。

接下来，探究LCA通过何种方式诱导SULT表达。已报道，LCA可以与某些核激素受体结合，包括法尼醇X受体（FXR或NR1H4）、孕烷X受体（PXR或NR1l2）、维生素D受体、组成型雄烷受体（CAR或NR1l3）以及类视色素相关的孤儿受体（RORa或RORA和RORg或RORC），从而诱导SULT表达。siRNA敲低VDR显著降低HepG2细胞中hSULT2A对LCA的依赖性表达，而PXR，FXR，CAR，RORa和RORg敲低并未显著影响hSULT2A表达（图3B）。SG小鼠肝Vdr表达也高于假手术组（图3C）。此外，在GF小鼠肝脏中，Vdr表达水平降低了约20倍，而在用抗生素处理的小鼠中，Vdr表达水平几乎无法检测到（图3D），这表明，肝脏中Vdr表达也需要菌群。最后，对Vdr基因敲除小鼠粪便BA进行分析，与野生型（WT）小鼠相比，CA7S水平显著降低，表明CA7S产生需要VDR（图3E）。此外，相关分析显示，SG小鼠LCA水平与mSult2A1和Vdr的肝表达之间存在显著相关性。

为了进一步验证体内LCA-VDR-SULT2A1-CA7S通路，将LCA（50 μM）直接注射到DIO小鼠门静脉中（图3F）。该浓度在SG小鼠门静脉中LCA的生理浓度范围内（图2B）。门静脉注射LCA2小时后，小鼠肝脏mSult2A1和Vdr表达水平显著增加（图3G和3H）。而且，胆囊中CA7S水平增加，这表明，门静脉注射LCA可导致CA7S合成并在胆囊中积聚（图3I）。由此说明，LCA（一种菌群代谢物）通过门静脉从肠道转移到肝脏，并诱导肝脏中mSult2A1表达和CA7S的产生，且CA7S水平升高是由LCA诱导的VDR激活所介导。

由以上数据推测LCA诱导的人或鼠肝细胞hSULT2A或mSult2A1表达增加导致CA7S合成增加，进而可以诱导GLP-1分泌。首先需要验证体外细胞水平上CA7S合成。HepG2细胞与CA（CA7S的前体）共培养发现肝细胞对CA吸收增加，但未检测到CA7S（图3J）。加入SULTs的磺酸盐供体所需的辅助因子PAPS（3‘-磷酸磷腺苷-5''-磷酸硫酸盐），可导致肝细胞产生CA7S（图3J）。再添加LCA导致CA7S显著增加（图3J）。siRNA敲低VDR可消除了LCA介导的CA7S合成增加，表明LCA需要VDR激活才能诱导hSULT2A表达和CA7S产生（图3J）。

接下来，考察HepG2细胞合成的CA7S在迁移实验中诱导人肠内分泌L细胞（NCI-H716）分泌GLP-1的能力（图3K）。肠道L细胞响应TGR5激活而分泌GLP-1。将NCI-H716细胞与诱导合成CA7S的HepG2细胞一起孵育，发现GLP-1分泌显著增加（图3L）。而siRNA敲低VDR可抑制了CA7S的合成进而导致GLP-1分泌减少，提示VDR的激活对于CA7S介导的GLP-1分泌是必要的（图3L）。由此说明，LCA-VDR-SULT通路在肠肝轴中诱导CA7S产生并诱导GLP-1分泌。

梭状芽胞杆菌簇XIV通过7a-脱羟基作用，将初级胆汁酸 CA和CDCA分别转化为脱氧胆酸（DCA）和LCA（图4A）。因为SG术后小鼠在门静脉中显示出较高水平的LCA，推测SG术后小鼠肠中菌群合成了更多的LCA。然而，实际胆汁酸分析结果显示SG术后小鼠盲肠中LCA水平显著降低，而DCA和总BAs水平未改变。SG术后患者粪便样本也有类似的变化。由此反映出小鼠和临床上SG均导致肠道菌群代谢物LCA水平降低，这与门静脉中观察到现象相反。

肠道LCA水平降低是否由SG术后产生LCA的肠道菌群减少导致？对假手术和SG小鼠盲肠内容物进行了16S rRNA测序。与之前研究一致， SG术后菌群发生显著变化，包括拟杆菌和变形菌丰度增加（图4B，4C），梭状芽胞杆菌（产生LCA的成员）平均相对丰度降低，但差异不显著（图4D）。LCA的菌群合成需要由BA诱导型（bai）操纵子中的基因编码的一系列酶起作用。与假手术组相比，SG术后baiCD基因表达显著降低（约100倍）（图4E）。在临床粪便样本中也观察到相似的菌群水平变化（图4F，4G），SG术后粪便样品中梭状芽胞杆菌的相对丰度显著降低（图4H），与其他报道一致。由此说明，SG术后菌群发生了改变，导致小鼠和人类肠道中LCA合成减少。而且，SG小鼠门静脉LCA水平增加并非由肠道细菌LCA合成所致。

SG术后门静脉中LCA水平升高，而肠道（GI）LCA水平下降，因此需要探究BA转运蛋白在促进LCA进入门静脉循环中的影响。BAs主动转运主要发生在回肠中（图5A）。通过qPCR测定假手术和SG小鼠回肠远端中BA转运蛋白表达水平，发现与假手术组相比，SG术后小鼠回肠中Asbt和Osta表达显著升高（图5B）。ASBT和OSTa主要介导BAs从肠到门静脉的转运，由此寿命，SG增加了BA进入门静脉的转运蛋白表达。

先前研究发现，BAs竞争性结合ASBT，并且ASBT的某些氨基酸残基与特定BAs具有不同的结合亲和力。但是，LCA尚未研究。鉴于观察到SG小鼠门静脉中LCA增加，因此进一步探究Asbt和Osta表达增加是否会诱导LCA从肠道到门脉循环的主动吸收。人肠道Caco-2细胞中BA转运实验结果发现，LCA的转运显著高于DCA，此外，siRNA敲低ASBT和/或OSTa可消除了LCA和TCA跨上皮单层的转运，这表明LCA和TCA需要ASBT和OSTa表达才能进行胞吞作用（图5E，5F）。此外，通过用特异性MEK抑制剂U0126处理分化的Caco-2细胞来过度表达ASBT导致LCA通过单层的转运增加（图5E，5F）。而且，ASBT过表达后，其他BA运输不变（图5E，5F）。这些结果表明，SG小鼠回肠中ASBT和OSTa表达增加导致LCA选择性进入门静脉的转运增加。

为了探究SG术后，LCA水平在门静脉中升高，而在盲肠和粪便中降低的原因，对BA是否影响转运蛋白ASBT表达进行分析。将Caco-2细胞分别与假手术和SG盲肠粪便等水平BA池一起孵育，观察BA池对Caco-2细胞ASBT表达的影响，结果发现，与假手术组相比，SG盲肠组的BA在体外可显著诱导ASBT表达（SG组盲肠LCA平均水平为35μM，假手术组LCA水平为75μM，图6B）。然而，正常生理浓度 100μM LCA孵育Caco-2细胞可显著抑制ASBT表达，且不会影响细胞活力（图6C）。这表明，SG术后肠道LCA水平下降导致Asbt表达增加，从而导致门静脉LCA水平增加（图6A）。

如果体内添加LCA是否会抑制Asbt表达？在GF小鼠给予0.3％LCA7天（图6D）。结果发现，LCA在整个胃肠道出现积聚（图6E），且显著抑制胃肠道Asbt表达（图6F），表明LCA在体内抑制Asbt表达。

尽管Asbt表达在下胃肠道受到抑制，但在肠道中添加LCA足以触发LCA-VDR-SULT通路并诱导CA7S的产生（图6G和6H）。这种作用可能是由于引入了高浓度的LCA（盲肠含量的平均值约为1100 μM，图6E）以及肠中ASBT表达水平，尽管抑制了Asbt表达，仍使LCA部分转运至肝脏 。而且， LCA喂养的GF小鼠胆囊和胃肠道中发现CA7S积聚（图6G）。用LCA喂养的小鼠肝mSult2A1表达水平显著升高（图6H）。与对照组相比，Vdr表达也增加了，尽管没有统计学差异（图6H）。由此说明，尽管LCA降低了这些小鼠的Asbt表达，但添加LCA却能够诱导肝脏CA7S的生物合成。

为了验证SG菌群是否可以诱导体内局部LCA转运和LCA-VDR-SULT通路，术后6周，将假手术和SG小鼠盲肠粪便进行厌氧均质化，然后将其移植给高脂饮食的GF小鼠CMT肠道菌群移植）（图7A）。两周常规饲养，检测Sham-CMT和SG-CMT组盲肠粪便中菌群baiCD表达。与先前结果一致，与假手术组相比，SG组baiCD表达水平显著降低，且在GF小鼠中趋势一样（图7B和7C）。同时SG-CMT小鼠的盲肠LCA水平较低，DCA或总BA水平无变化，与之前观察到的情况相似（图7D）。

最后，探究SG小鼠的CMT是否在体内重建了LCA-VDR-SULT-CA7S通路。与体外研究结果一致，结果表明LCA抑制了Asbt和Osta表达，与假CMT相比，SG-CMT小鼠在回肠末端的Asbt和Osta的表达显著升高（图7E）。此外，与Sham-CMT相比，SG-CMT小鼠LCA门脉转运增加，而其他BA水平不变（图7F）。这些数据表明，SG菌群通过门静脉诱导LCA从肠道到肝脏的转运增加。SG-CMT小鼠肝Vdr和mSult2A1表达水平以及盲肠中CA7S水平显著增加（图7G，7H）。SG-CMT组GLP-1水平比Sham-CMT组升高约50％，尽管差异不显著（图7I）。可能是因为菌群需要超过2周时间才能重塑CA7S途径诱导GLP-1分泌。与Sham-CMT组相比，SG-CMT小鼠回肠远端Tgr5表达显著增加，表明SG术后菌群增加了Tgr5表达（图7J）。这些数据表明，菌群足以触发LCA-VDR-SULT-CA7S通路和Tgr5诱导。

本研究证明了一种特定的肠道菌群代谢物石胆酸（LCA）通过诱导人肝细胞和鼠肝中CA7S的合成来影响宿主代谢。SG术后小鼠诱导从肠道经门静脉运输到肝脏的LCA量增加。LCA激活维生素D受体（VDR）诱导胆酸（CA）磺化，揭示了肠道菌群与宿主在肝肠轴“交流”的潜在机制。LCA介导的肝内CA7S合成可诱导肠内分泌细胞GLP-1的分泌，为SG术后BA变化与该方式的代谢益处之间的机制提供了依据。由此说明，SG术后菌群的改变导致负责产生抗糖尿病代谢物CA7S通量增加进而诱导GLP-1分泌，最后改善糖尿病。

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