2021-01-22 22:49:38, 东曹技术中心 东曹(上海)生物科技有限公司
前言
近年来,重组质粒DNA (pDNA) 被越来越多地用作基因治疗原料药 (例如: 用于生产慢病毒和AAV载体) 以及DNA疫苗的活性成分。药物级质粒DNA必须要符合宿主相关杂质、均一性方面的要求 (例如: pDNA拓扑异构体的含量: 共价闭环的超螺旋 (CCC)、开环 (OC) 和线型 (L) 以及二聚体或多聚体)。在大规模质粒发酵过程中,质粒主要以超螺旋形式存在。进入到下游工艺时,一些质粒可能会出现缺口,转化为开环和线型的形式。
在本篇推送中,我们将介绍一种使用阴离子交换色谱柱TSKgel DNA-NPR对pDNA样品进行快速、准确表征的HPLC分析法1)。并且,该方法可以非常容易地从HPLC转移到UHPLC系统。
1. 实验条件
实验中以pBR322 (第一种广泛使用的大肠杆菌克隆载体) 为例。质粒pBR322的长度为4361个碱基对,分子量为2.83×106Da。为了正确分类拓扑异构体,我们用限制性单切酶EcoRI来孵育制备线型质粒。pBR322在位置4359处具有一个EcoR1限制性酶切位点。消化时,每μg DNA使用1单位的限制性内切酶。讲样品在37℃下孵育60分钟后,通过将温度提升至65℃并加热20分钟来终止反应。
2. 快速分离质粒拓扑异构体
图1是使用TSKgel DNA-NPR分析pBR322的色谱图。在5分钟的线性梯度下以1.0 mL/min流速分析质粒。3个洗脱峰代表了质粒的三种不同类型:超螺旋、开环和线型。其中,最高峰对应超螺旋质粒。
图1. pBR322的AEX分离谱图
线型质粒的分析条件与超螺旋质粒相同。图2的单峰色谱图表示的是EcoR1消化后的线型质粒。图3是两个色谱图的叠加图。可以证实峰3对应了线型质粒。
图2. EcoR1消化后的线型pBR322的分离谱图
图3. 叠加图
3. 总结
TSKgel DNA-NPR离子交换色谱柱由2.5μm的亲水性无孔聚合物颗粒充填,颗粒表面采用弱阴离子交换基团修饰。无孔颗粒能够实现快速传质,这是实现高分辨率分离的关键因素。
使用TSKgel DNA-NPR能够简便、快速地区分出超螺旋、开环和线型三种不同形式的质粒DNA。该分析方法非常适用于药物级pDNA研发和生产的各个阶段,而且还可同时用于HPLC和UHPLC系统。
4. 参考文献
1.Characterization of Plasmid DNA Samples by Chromatographic Methods; Hermann Schuchnigg,Patricia Cantarell,Christoph Pollak,Jochen Urthaler,Wolfgang Buchinger;Boehringer Ingelheim Austria GmbH, Poster HPLC 2008,Baltimore,MD,USA
东曹色谱产品在质粒DNA纯化与分析中的应用新冠病毒关联药物和疫苗研发的东曹解决方案东曹色谱产品在病毒载体分离纯化中的应用重组SARS-CoV-2S蛋白的SEC分析表征重组腺相关病毒的快速定量分析
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