多肽类药物分析

小分子肽是介于氨基酸和蛋白质之间的一种生化物质，是多个氨基酸聚合而成的短链，与蛋白质之间一直未有明确界限。多肽的制备方法主要有天然提取，化学合成，基因工程，和生物重组法等，结构相对简单的多肽最常用化学合成的方法制备获得，是多肽药物的主要制备方式。

一般有6种结构分析：

质谱—经典的多肽测序方法包括N末端序列测定的化学方法。

核磁共振—NMR可用于确定氨基酸序列及定量混合物中的各组分含量等。

红外光谱—用红外光谱法研究多肽等的结构、构象，能反映与正常生理条件(水溶液、温度、酸碱性等）相似情况下的生物大分子的结构变化信息。

紫外光谱—在研究生物大分子的溶液构象时，紫外可见吸收光谱是十分重要的方法。

圆二色谱—研究分子的立体结构、反应动力学及在溶液中的构象变化等。

X射线晶体学—X射线晶体学方法是迄今为止研究蛋白质结构最有效的方法，所能达到的精度是任何其他方法所不能比拟的。

我们来说说常用的质谱方法。

与传统的化学药物和蛋白质类似药物相比，多肽药物具有活性显著，特异性较强，与受体的亲和性好，毒性较弱且不易在体内蓄积；与蛋白类大分子药物相比，除了多肽疫苗外，多肽类药物免疫原性相对较小，用药剂量少，单位活性更高，易于合成、改造和优化，产品纯度高，质量可控，能够迅速确定药用价值。

由于具有较高的灵敏度、准确性、易操作性而备受关MS用于多肽序列测定时，灵敏度及准确性随分子量增大而明显降低，所以采用MS进行多肽序列分析比蛋白质简单，许多研究均是以多肽作为分析对象。

多肽的生物分析主要包括PK药代动力学试验，TK毒代动力学试验以及抗药抗体ADA试验。分析所用到的方法主要包括LC-MS/MS和LBA配体受体结合试验。

     一条多肽产品中除了多肽本身还包括生产过程中带入的水份及有机盐分等杂质，多肽纯度仅指多肽本身所含肽产品的含量及杂质的含量，不包括水份等杂质；而多肽含量则是指目标多肽在产品中的净含量，一般以N元素分析或氨基酸分子的方法来检测；因此一条多肽即使纯度达到99%，因为产品中还包含水份及有机盐分等，它的含量可能也只有70-80%。

  2. 为什么流动相中要加入三氟乙酸作为离子对试剂，还有哪些流动相体系或离子对试剂可用于多肽的分离纯化？

加入三氟乙酸能调节洗脱液的PH，同时作为离子对试剂与多肽相互作用，从而增强分离效果，明显改善峰形。

其它可用于多肽分离纯化的流动相体系或离子对试剂包括醋酸体系，磷酸体系，盐酸体系，七氟丁酸等通过适当的调节PH都能取得很好的分离效果。

另外三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去，另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200nm，对多肽在低波长处的检测干扰很小。

  3.检验多肽的色谱柱出现柱压升高，柱效下降该如何解决？

日常对色谱柱冲洗维护可以遵循色谱柱出厂说明书，但是在分析多肽等蛋白质样品时还容易出现一种现象：蛋白污染。主要是柱头端填料出现结块，如果出现蛋白污染，建议使用乙腈-水-三氟乙酸 = 50-50-0.1小流速反向冲洗60倍柱体积或者反向冲洗过夜。

毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE）--分离分析方法，CE是在传统的电泳技术基础上于本世纪60年代末由Hjerten发明的，其利用小的毛细管代替传统的大电泳槽，使电泳效率提高了几十倍。此技术从80年代以来发展迅速，是生物化学分析工作者与生化学家分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。