小融开讲啦丨第五期 成像质谱之样品前处理

今日内容：

在经过前面四期科普后

想必大家对成像质谱

都有了一定的了解

（第一期 浅谈成像质谱、第二期 成像速率、

第三期 灵敏度、第四期 空间分辨率）

关于成像质谱

我们还剩最后一个关键词：

样品前处理

本期小融就为大家讲讲

这其中的关键步骤及操作

小编

小融，为什么样品的前处理也要列到成像质谱的关键词里呢？

小融

因为对于MALDI-TOF MS成像质谱技术来说，样本制备过程是影响成像质谱结果真实性和准确性的关键环节。样本处理方法和技术与待测物自身的性质、所处的样本类型和状态密切相关。

小编

可能有的小伙伴还不太熟悉切片制备流程，你先来给我们讲讲吧！

小融

没问题~

01切片制备流程

MALDI-TOF MS成像质谱切片制备流程示意图

组织切片的制备关系到MALDI-TOF MS成像质谱结果的真实性和准确性，所以切片制备过程一定要认真仔细，要注意以下事项:

➢ 为了很好地维持细胞的形态和细胞内可扩散离子的空间分布，避免待测物的移位和降解，样本一经收集应迅速固定。最常用的固定方法是快速冷冻，通常采用液氮进行。人体皮肤直接接触液氮超过2秒会冻伤且不可逆转，做实验的小伙伴们一定要注意安全哦！

➢ 经液氮冷冻的组织过于脆硬，不宜直接切片。需将液氮冷冻后的组织样品放在-20ºC 冰箱或-80℃低温冰箱冷冻1小时以上。

➢组织样本不能用OCT（optimal cutting temperature compound，是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物）等包埋试剂包埋，会产生杂峰，影响质谱结果。

➢ 切片之前，要先用乙醇擦洗冷冻切片机的刀片，除去先前实验可能残存在刀片上的OCT等杂质，这个就不用多说了吧。

➢冷冻切片机切片，温度控制在-16℃~-26 ℃，一般组织密度越大，切片温度越高。切片的厚薄要适当，切片过薄，容易在转移过程中撕裂；切片过厚，则不利于清洗除去一些对离子信号有干扰的物质，且导电性差。

➢ 组织切片须放置在ITO载玻片涂有导电材料的一面，千万不要放错啊！因为MALDI-TOF MS是靠电场作用将离子送入飞行管的。ITO（Indium-Tin Oxide，氧化铟锡）载玻片，一面镀有导电的ITO膜，是这样的：

ITO载玻片

➢样本转移至载玻片后，需立即进行干燥处理以保持样本稳定。常用的干燥方法有冷冻干燥、真空干燥、溶剂脱水干燥和氮气吹干等。

➢ 干燥后的样本一般可直接进行质谱分析，复杂样本中特定待测物的检测常需采用溶剂清洗、表面酶解和化学衍生化等对分析表面进行适当处理，既能起到脱水固定作用，还能显著改善质谱测定结果。溶剂清洗后，需要再次进行干燥处理。

➢ 将每个制备好的样品玻片分别放入载玻片盒或是50mL离心管中低温保存。如需长期保存，需置于-80℃环境。

小融

总之，样品前处理是成像质谱的基础，前处理做好了，才会有比较好的成像质谱结果。切片制备虽然简单，但还是需要实验人员细心、耐心，另外还得有一颗热爱科研的心。

02切片的基质喷涂

在过去几十年中，基质辅助激光解吸电离(MALDI)成像质谱技术已被广泛应用在生物标志物发现和药物研发等多个领域。然而，在MALDI成像质谱的技术操作中，要想获得质量高、重复性好的质谱结果，并没有那么容易。目前，仍然有诸多因素制约着这一技术的应用和发展，其中基质喷涂便是“瓶颈”之一，要尽可能的满足组织切片上的待测物无扩散或移位现象，基质能与组织表面分子形成良好的共结晶，协助目标分子的高效电离。

基质喷涂技术是利用喷涂装置将具有特殊物理化学性质的化合物喷涂在组织切片上，该类化合物喷涂后应均匀的分布在组织切片表面，且其颗粒大小越小越好。有研究表明基质在组织切片上分布的均匀度、结晶度和晶体颗粒的大小等因素是决定成像质谱质量的关键因素。

目前，MALDI成像质谱研究中主要采用的基质附着装置有手动喷枪，基质升华仪器，全自动喷涂仪等。

手动基质喷枪

空气喷枪是最早使用的基质喷涂方法，其原理是当基质流入枪膛后，利用压缩空气携带其喷涂至组织表面或被分析物的表面。这种装置结构简单，维护容易并且喷涂速度快。缺点是，由于该方法主要采用人工手动操作，每次喷涂的均匀度、厚度不一，基质结晶颗粒较大，重复性差。

基质升华仪器

全自动基质喷雾仪

真空升华装置是一种无需溶剂的喷涂基质方法，可以将基质均匀地覆盖在组织表面。其原理是利用固体物质在高真空条件下升华点降低的特性，在高真空密闭容器内加热这些物质，使其快速升华，附着至被测组织表面，从而形成均匀的基质层。真空升华装置结构简单，形成的基质结晶颗粒较小且均匀，避免了被测分子在喷涂基质及结晶过程中的移位。但是，由于该装置是基于物质分子升华的原理，因此，具有高升华点的基质分子难以利用该装置进行喷涂，且基质喷涂的量难以控制。

全自动基质喷雾仪是将基质液滴均匀喷涂在组织切片表面，液滴干燥后形成均匀的固体结晶膜。基质喷雾仪通过喷嘴可以产生细腻的溶液喷雾，得到的液滴更小，形成的基质结晶直径小，具有高空间分辨率和高重现性的特点。缺点是，雾化喷头容易堵塞。

离子化辅助基板

虽然，基质附着装置技术越来越先进，基质喷涂所耗时间越来越短，但是在MALDI成像质谱前处理阶段，基质的配制、涂布、干燥等流程共耗时约30分钟，且要求基质在待测样品上涂布均匀。

为了减少样品前处理时间，提高MALDI成像的分辨率和重现性，很多研究人员将精力集中在研究免基质成像质谱方面。通过纳米技术，将低丰度生物小分子、蛋白等进行选择性富集，建立免基质的MALDI-MS检测方法。还有人研究出了新型的离子化辅助基板，该基板使用多孔纳米材料开发，原理是利用毛细作用使待测样品的分子上升到表面，通过激光照射使其离子化而不破坏分子结构，实现成像质谱分析。离子化辅助基板能够大幅缩减成像质谱分析样品前处理时间，且操作简单。但是，目前离子化辅助基板只适用于小分子分析物。

小融讲质谱 

总之，不论是切片还是基质喷涂，样品前处理对MALDI成像质谱来说非常关键，省时、省力，能大幅提高MALDI成像质谱分辨率和重现性的样品前处理方法，还有待各位有志之士去开发！

成像质谱专题到这儿就告一段落了，后续小融还会带来更多科普知识，敬请期待~

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作为一家拥有自主知识产权的研发型高科技企业，公司成立以来累计研发投入超过5000万元，目前已拥有“宽谱定量飞行时间质谱（新一代基质辅助激光解吸飞行时间质谱）”及“微流控芯片核酸快速分析”两大技术平台，其中“宽谱定量飞行时间质谱平台”被两院院士组成的鉴定委员会鉴定为“整体性能达到国际先进水平”。

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